血清miR-200c-3p 表達(dá)水平對(duì)判斷新生兒呼吸窘迫綜合征嚴(yán)重程度和預(yù)后的價(jià)值

古裕鳥 霍開明 莊秀娟 蔣家敏 吳小紅 黃旭芳

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科（海南海口 570311）

新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是指原發(fā)性或繼發(fā)性肺泡表面活性物質(zhì)減少導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病，其病情進(jìn)展快、病死率較高，是一種嚴(yán)重威脅新生兒生命的呼吸危重癥[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類新型的基因調(diào)控分子，可通過(guò)影響靶基因的表達(dá)而調(diào)控炎癥通路和免疫反應(yīng)，在急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發(fā)病過(guò)程中起重要作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c-3p在炎癥性肺疾病中發(fā)生表達(dá)變化，參與多個(gè)信號(hào)通路和各種免疫炎癥反應(yīng)過(guò)程，在ARDS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。然而，miR-200c-3p在NRDS中的表達(dá)及其臨床意義尚未有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)ARDS新生兒血清miR-200c-3p表達(dá)水平，分析其對(duì)NRDS預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，旨在為NRDS救治提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取2016 年6 月至2019 年6 月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的NRDS新生兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒(2017年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②經(jīng)影像學(xué)檢查（X 線胸片顯示雙肺彌漫性陰影伴肺水腫改變，超聲心動(dòng)圖檢查無(wú)左心房高壓表現(xiàn)），并結(jié)合臨床癥狀及體征確診；③急性起病，重癥監(jiān)護(hù)室機(jī)械通氣時(shí)間≥72小時(shí)，胎齡＞32周。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺外嚴(yán)重感染；②原發(fā)性肺泡表面活性物質(zhì)缺乏、先天性心臟病、先天性代謝紊亂；③肺和胸壁畸形及其他嚴(yán)重的先天畸形。

以新生兒診斷為NRDS為研究起點(diǎn)，痊愈出院或死亡作為研究終點(diǎn)，將其分為生存組（治愈和病情好轉(zhuǎn)出院）和死亡組（病情危重放棄治療和死亡）?；純阂罁?jù)入院24 小時(shí)內(nèi)首次胸片結(jié)果及病情嚴(yán)重程度分為輕度組（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）和重度組（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）。所有患兒均有新生兒ARDS特征性的X 線表現(xiàn)。Ⅰ級(jí)：兩肺野透亮度明顯降低，可見均勻散在的細(xì)小顆粒和網(wǎng)狀陰影；Ⅱ級(jí)：除Ⅰ級(jí)變化加重外，可見支氣管充氣征，延伸至肺野中外帶；Ⅲ級(jí)：病變加重，肺野透亮度更加降低，心緣、膈面模糊；Ⅳ級(jí)：整個(gè)肺野呈白肺，支氣管充氣征更加明顯，似禿葉樹枝。所有患兒確診后12 小時(shí)內(nèi)應(yīng)用新生兒急性生理學(xué)評(píng)分圍生期補(bǔ)充II（Perinatal Supplement of Acute Physiological Score for Neonates II，SNAPPE-II）進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分范圍0～162分，分值越高，病情越重。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 記錄患兒入院時(shí)的胎齡、性別、出生體質(zhì)量、病因及母親的基本情況。

1.2.2 miR-200c-3p檢測(cè) 所有患兒于確診次日采集空腹靜脈血5 mL置未加抗凝劑的離心管中，離心分離血清（離心力2 054×g、離心時(shí)間10 min），-80℃低溫冰箱保存。應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉(zhuǎn)錄已定量的RNA，選用U 6 作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為15 μL：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸（dNTPs），1.00 μL逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μL），10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.50 μL，0.19 μL RNase抑制劑（20 U/μL），4.16 μL無(wú)菌三蒸水。反應(yīng)參數(shù)：16℃反應(yīng)30 min，42℃反應(yīng)30 min，85℃反應(yīng)5 min，4℃恒溫放置保存，每個(gè)反應(yīng)均為1個(gè)循環(huán)。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：1 μL 引物及探針Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液，1.33 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μL無(wú)核酸酶的水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃變性15 s、60 ℃復(fù)性60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-200c-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-200c-3p表達(dá)水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS死亡的價(jià)值，曲線下面積（area under cure，AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒基本情況

102例NRDS患兒胎齡32～41周，中位胎齡37.0周；出生體質(zhì)量2 690 g（2 560～2 920）g；足月兒46例，早產(chǎn)兒56例。46例足月兒中男29例、女17例，胎齡37～41周，中位胎齡39.5周，出生體質(zhì)量2 862 g（2 685～3 170）g；56例早產(chǎn)兒中男35例、女21例，胎齡32～37周，中位胎齡34.80周，出生體質(zhì)量2 530 g（2 382～2 610）g。

2.2 死亡組和生存組一般資料比較

死亡組和生存組性別比、胎齡、出生體質(zhì)量、病因構(gòu)成、母親年齡以及雙胎、剖宮產(chǎn)及羊水異常比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2 .3 死亡組和生存組miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分比較

死亡組血清miR-200 c-3p 表達(dá)水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分均明顯高于生存組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 重度組和輕度組miR-200 c-3p 表達(dá)水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分比較

重度組血清miR-200c-3p 表達(dá)水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分、病死率均明顯高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.5 血清miR-200 c-3p 及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS死亡的價(jià)值

血清miR-200c-3p表達(dá)水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS 患兒死亡的最佳截值分別為0.52、23.60分。miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS患兒死亡的AUC為0.93（95%CI：0.87～0.98），明顯高于單項(xiàng)miR-200c-3p（0.84，95%CI：0.78～0.90）及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分（0.80，95%CI：0.75～0.86），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=5.32、5.87，P均＜0.05），其靈敏度和特異度為94.0%和88.5%。見表3、圖1。

2.6 血清miR-200c-3p水平與SNAPPE-Ⅱ評(píng)分相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，NRDS 患兒血清miR-200 c-3p 表達(dá)水平與SNAPPE-Ⅱ評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r=0.84，P＜0.001）。

表1 死亡組和生存組臨床資料比較

圖1 miR-200c-3p 水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS 死亡ROC 曲線

表2 重度和輕度組miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分比較

3 討論

目前NRDS缺乏特效治療手段，仍是以呼吸支持、肺表面活性物質(zhì)替代、體外膜肺氧合、營(yíng)養(yǎng)支持及液體管理等對(duì)癥及綜合治療為主，治療難度較大，病死率仍然較高。因此，如何早期預(yù)測(cè)NRDS的預(yù)后，進(jìn)而針對(duì)其進(jìn)行綜合治療，對(duì)提高患兒的預(yù)后及降低病死率具有重要意義。miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA，通過(guò)miRNA 剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、血管生成以及炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。相關(guān)研究表明，miRNA 參與了ARDS的發(fā)生、發(fā)展，在ARDS 炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中起重要的調(diào)控作用，有望成為ARDS的新型生物標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ARDS中發(fā)生表達(dá)變化，miRNA 參與上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的病理生理過(guò)程，決定了ARDS患者的病程進(jìn)展和預(yù)后[9]。SNAPPE-Ⅱ評(píng)分是一種應(yīng)用較廣的新生兒危重病例評(píng)分系統(tǒng)，對(duì)新生兒危重癥有良好預(yù)測(cè)價(jià)值，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)多種新生兒危重疾病的預(yù)后[10]。

表3 miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS死亡的價(jià)值

本研究顯示，死亡組血清miR-200 c-3p 表達(dá)水平及SNAPPE-II評(píng)分均明顯高于生存組，重度組血清miR-200c-3p表達(dá)水平、SNAPPE-II評(píng)分及病死率均明顯高于輕度組，提示血清miR-200c-3p表達(dá)水平及SNAPPE-II評(píng)分與NRDS的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，miR-200c-3p表達(dá)水平高的RDS新生兒預(yù)后較差，發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA表達(dá)水平在NRDS中明顯升高，且與NRDS病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)[11]。另有研究表明，采用SNAPPE-II評(píng)分對(duì)RDS患兒預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，可預(yù)測(cè)其死亡的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，SNAPPE-II評(píng)分越高，RDS患兒的死亡風(fēng)險(xiǎn)越大[12]。本研究相關(guān)分析顯示，NRDS患兒血清miR-200c-3p表達(dá)水平與SNAPPE-II評(píng)分呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明血清miR-200 c-3p 表達(dá)水平與NRDS 的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究應(yīng)用ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-200c-3p表達(dá)水平及SNAPPE-II評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS死亡的最佳截值分別為0.52、23.60分，miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-II評(píng)分預(yù)測(cè)NRDS死亡的AUC最大，其靈敏度和特異度較好。相關(guān)研究認(rèn)為，miRNA通過(guò)作用于靶mRNA，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與肺的發(fā)育及損傷修復(fù)過(guò)程，并在NRDS中發(fā)生差異表達(dá)，可作為NRDS的潛在治療靶點(diǎn)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200 c-3p 與NRDS 的疾病發(fā)展和嚴(yán)重性有關(guān)，可作為NRDS 預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，同時(shí)也為臨床治療NRDS 提供新的思路[14]。另有研究表明，SNAPPE-II 評(píng)分越高，NRDS死亡風(fēng)險(xiǎn)越大，早期進(jìn)行SNAPPE-II評(píng)分評(píng)估，有利于預(yù)測(cè)NRDS病情危重程度及預(yù)后情況，對(duì)改善患兒預(yù)后具有重要意義[15]。

綜上所述，血清miR-200 c-3p 表達(dá)水平升高與NRDS病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，miR-200c-3p聯(lián)合SNAPPE-II評(píng)分對(duì)NRDS 預(yù)后判斷具有較高的價(jià)值，miR-200c-3p有望作為NRDS潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。但這些研究仍處于初步階段，今后尚需更多的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)miR-200c-3p在NRDS中的應(yīng)用價(jià)值，使之成為診療NRDS的新途徑。