不同烤煙品種煙葉衰老特性與內(nèi)源激素的關(guān)系

魏 星，武云杰，闞洪贏，蔡文龍，張小全

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63 號(hào) 450002

烤煙是以收獲葉片為目的的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉成熟的過程即是逐漸衰老的過程，此階段也是煙葉品質(zhì)形成最關(guān)鍵的時(shí)期[1-2]。植物衰老是由基因調(diào)控并受內(nèi)外因素的影響，最終導(dǎo)致整株植物的死亡[3]。其中，植物激素對(duì)于葉片的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程有重要的調(diào)控作用[4]，這些激素一般分為延遲衰老和促進(jìn)衰老兩大類，共同調(diào)節(jié)植物的衰老[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外部環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，環(huán)境壓力會(huì)間接促進(jìn)加速衰老的激素含量升高，同時(shí)促進(jìn)生長(zhǎng)類的激素含量下降，主要過程是植物激素影響感知信號(hào)ETR1、TIR1 等，通過傳導(dǎo)信號(hào)EIN、MYC、bHLH3 等傳遞至衰老受體SAGs 和SEN 等衰老相關(guān)基因[7-10]。逆境脅迫研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)日照可促進(jìn)GA 合成，有利于植物生長(zhǎng)；短日照則促進(jìn)ABA 合成，加速植物體衰老。低溫和高溫、水分脅迫、無機(jī)營(yíng)養(yǎng)不足等逆境均可加速植物葉片的衰老[11]。目前，已從水稻、擬南芥等模式植物中克隆出了多個(gè)與衰老相關(guān)的基因，根據(jù)這些基因在葉片衰老期表達(dá)量的變化，分為衰老下調(diào)基因（SDGs）和衰老上調(diào)基因，也稱為衰老相關(guān)基因（SAGs）[12]。在植物體衰老期間，參與植物光合作用、生物合成相關(guān)的基因表達(dá)量下調(diào)；葉片衰老過程中大分子化合物被降解轉(zhuǎn)移，大量編碼蛋白酶及參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因會(huì)在葉片衰老過程中表達(dá)上調(diào)[13-14]。還有一些高度衰老特異表達(dá)基因，只在葉片衰老程度較高時(shí)才被檢測(cè)出上調(diào)表達(dá)，如LSC54、SAG12 和SAG13[15]等。但目前激素與衰老的關(guān)系研究多集中在逆境脅迫條件下，而對(duì)于煙葉衰老方面的研究多集中在施氮量對(duì)質(zhì)體色素含量、氮代謝、成熟采收等方面的影響[16-17]，有關(guān)烤煙內(nèi)源激素調(diào)控的相關(guān)基因與衰老相關(guān)基因的關(guān)系方面則鮮見報(bào)道，同時(shí)品種間衰老特性的差異研究也較少。為此，選取田間成熟落黃表現(xiàn)不同的4 個(gè)烤煙品種豫煙10 號(hào)、云煙87、K326 和NC89，在相同栽培管理?xiàng)l件下，對(duì)不同葉齡中部葉的葉綠素含量、衰老標(biāo)志基因、內(nèi)源激素含量及相關(guān)基因表達(dá)量的變化進(jìn)行了分析，旨在明確不同烤煙品種煙葉衰老特性與內(nèi)源激素變化的關(guān)系，為進(jìn)一步調(diào)控?zé)熑~衰老進(jìn)程、選育適宜衰老特性的品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018 年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)進(jìn)行。供試材料為多年種植觀察田間成熟落黃表現(xiàn)不同的4 個(gè)烤煙品種豫煙10 號(hào)、云煙87、K326 和NC89。土壤類型為輕壤土，有機(jī)質(zhì)10.77 g/kg、全氮0.96 g/kg、堿解氮48.7 mg/kg，速效磷51.8 mg/kg，速效鉀103.7 mg/kg，pH 7.56。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，每小區(qū)面積120 m2，行株距為120 cm×50 cm。3 月1 日播 種，5 月5 日 移 栽，施純 氮45 kg/hm2，N ∶P2O5∶K2O=1∶2:3。肥料為煙草復(fù)合肥（10-12-18）、重過磷酸鈣和硫酸鉀。5 月5 日施入基肥，6 月5 日追肥，基追肥比例為7∶3，打頂后單株留葉20 片。其他田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

選取整齊一致的煙株，以中部葉第10～12 片葉（自下向上數(shù)）為研究對(duì)象，以葉長(zhǎng)1.5 cm 時(shí)掛牌計(jì)算葉齡，分別于葉齡30、40、50、60 和70 d 時(shí)取樣。每個(gè)品種每次從5 株煙上分別取5 片葉，取中部葉片，以主脈為界分成兩部分，充分剪片混勻分兩份保存，一部分用于測(cè)定內(nèi)源激素和葉綠素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；另一部分用液氮迅速冷卻帶回實(shí)驗(yàn)室，并于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于衰老標(biāo)志基因和激素相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

采用分光光度法測(cè)定葉綠素含量[18]。采用酶聯(lián)免 疫 吸 附 法[19]測(cè) 定 脫 落 酸（ABA）、生 長(zhǎng) 素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）含量。

按照TRIZOL（Invitrogen 公司）試劑說明書中的步驟進(jìn)行樣品總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄模版用量為2 μ g，參 照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas 公司）產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。采用PCR 儀（iQ5，美國Bio-Rad 公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值的變化。將CT值導(dǎo)入Excel 2007，按照公式2-△△CT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[20]，并繪制相關(guān)圖形。以煙草L25基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 2007 和Excel 2010 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析以及圖形的繪制，用Duncan’s 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中葉綠素含量的變化

從葉齡30 d 開始，4 個(gè)烤煙品種的葉綠素含量均開始下降，品種間變化規(guī)律一致，見圖1。葉綠素含量在葉齡60 d 時(shí)品種間差異不顯著，但在葉齡60～70 d 時(shí)，豫煙10 號(hào)品種葉綠素降解量增大，降解量達(dá)到0.46±0.02 mg/g，在葉齡70 d 時(shí)的葉綠素含量顯著低于其他品種。NC89 品種在該時(shí)期葉綠素含量較其他品種仍然保持較高水平。

圖1 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中葉綠素含量的變化Fig.1 Variations of chlorophyll content during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

2.2 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中衰老標(biāo)志基因表達(dá)量比較

圖2 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中衰老標(biāo)志基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.2 Variations of senescence marker genes during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

CP1 在葉齡50 d 時(shí)，云煙87、K326 和豫煙10號(hào)品種的表達(dá)量顯著升高，其中豫煙10 號(hào)較上一時(shí)期變化量最大，是上一時(shí)期的3.05 倍（圖2A）。品種間差異顯著，表達(dá)量最高的豫煙10 號(hào)與其他3 個(gè)烤煙品種間存在極顯著差異。在葉齡60 d時(shí)，4 個(gè)品種的表達(dá)量均表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，說明此時(shí)期各品種均有明顯的衰老變化。其中豫煙10號(hào)表達(dá)量最高，達(dá)到了27.756，且與其他3 個(gè)烤煙品種間存在極顯著差異。云煙87 較上一時(shí)期也出現(xiàn)明顯增幅。而NC89 和K326 增幅相對(duì)較小，兩個(gè)品種間無差異。在葉齡70 d 時(shí)，各品種的表達(dá)量持續(xù)增高。而NC89 的表達(dá)量依然相對(duì)同時(shí)期其他品種較低且與其他3 個(gè)品種間差異極顯著，這一品種間差異和變化趨勢(shì)與CP1 趨勢(shì)一致（圖2B）。

4 個(gè)烤煙品種的PSA1 基因表達(dá)量表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，品種間變化規(guī)律一致（圖2C）。在葉齡30 d 時(shí)，NC89 和K326 品種的表達(dá)量相對(duì)較高，但兩個(gè)品種間無差異；而云煙87 和豫煙10 號(hào)的表達(dá)量較低，品種間無差異；但表達(dá)量較高的兩個(gè)品種與表達(dá)量較低的兩個(gè)品種之間均存在顯著差異。從葉齡40～60 d，PSA1 基因表達(dá)量持續(xù)降低，品種間差異不顯著。而在葉齡70 d 時(shí)，表達(dá)量達(dá)到了最低值，其中豫煙10 號(hào)品種表達(dá)量最低，NC89 品種表達(dá)量相對(duì)較高，兩個(gè)品種間表現(xiàn)出極顯著差異。MC 基因表達(dá)模式與PSA1 相似（圖2D）。說明在不同烤煙品種的衰老過程中，NC89品種在生長(zhǎng)發(fā)育的后期較其他3 個(gè)品種生長(zhǎng)旺盛，而豫煙10 號(hào)則衰老程度較高。

2.3 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量比較

圖3A 顯示，在煙草衰老葉片中IAA 含量逐漸降低，4 個(gè)烤煙品種的下降速率出現(xiàn)差異，豫煙10號(hào)品種在葉齡60 d 時(shí)，IAA 急劇下降，當(dāng)葉齡70 d時(shí)其含量下降到最低水平；從葉齡60～70 d 時(shí)，K326 品種的IAA 含量降幅最大，云煙87 降幅次之，而NC89 在葉齡50～70 d 之間，降幅變化最小，尤其是葉齡60 和70 d 時(shí)，NC89 的IAA 含量在4 個(gè)烤煙品種中含量最高，且與其他品種間差異達(dá)到極顯著水平。

GA3和CTK 在衰老過程中整體上也呈下降趨勢(shì)，NC89 品種在衰老進(jìn)程中含量始終保持較高水平，說明NC89 在4 個(gè)烤煙品種中衰老變化不明顯（圖3B、圖3C）。ABA 含量（圖3D）在衰老過程中出現(xiàn)先上升后下降而后上升的變化趨勢(shì)，品種間變化規(guī)律一致。在葉齡50～60 d 時(shí)，4 個(gè)烤煙品種的ABA 含量均開始上升，豫煙10 號(hào)升高幅度最大，NC89 升幅最小，而與ABA 有拮抗作用的GA3表現(xiàn)出相反的變化規(guī)律，這說明ABA 和GA3共同調(diào)節(jié)煙葉的衰老進(jìn)程，但作用相反。

2.4 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中內(nèi)源激素代謝相關(guān)基因表達(dá)量變化

圖3 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量的變化Fig.3 Variations of endogenous hormone contents during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

NtEFE26 是乙烯合成依賴基因，在煙葉衰老過程中4 個(gè)烤煙品種NtEFE26 基因的表達(dá)量均呈先上升后下降而后上升的趨勢(shì)，品種間變化規(guī)律一致（圖4A）。在葉齡40 d 時(shí)，NtEFE26 基因表達(dá)量出現(xiàn)升高，說明在此時(shí)期煙葉乙烯合成旺盛。當(dāng)葉齡在50～70 d 之間時(shí)NtEFE26 基因表達(dá)量持續(xù)升高，在葉齡70 d 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是高等植物ABA 生物合成的關(guān)鍵調(diào)控酶，在衰老過程中4 個(gè)烤煙品種的NtNCED1 基因表達(dá)量（圖4B）變化規(guī)律與ABA相似。在葉齡40 d 時(shí)出現(xiàn)了較大幅度的上調(diào)表達(dá)，這可能是由于在此時(shí)期，田間出現(xiàn)的干旱情況，導(dǎo)致該基因表達(dá)量升高，進(jìn)而ABA 的含量有所升高，來應(yīng)對(duì)出現(xiàn)的短暫干旱脅迫。在衰老后期，葉齡60～70 d 時(shí)NC89 的表達(dá)量增幅緩慢，因此導(dǎo)致其ABA 含量上升緩慢，其衰老程度較低。NtPR1b 基因相對(duì)表達(dá)量（圖4C）隨著煙葉衰老其表達(dá)量逐漸升高，而NtCHN50 基因表達(dá)量（圖4D）則逐漸降低，說明隨著葉片衰老進(jìn)程的加劇，對(duì)衰老有促進(jìn)作用的JA 含量逐漸升高，而延緩葉片衰老的SA 含量則逐漸降低。在葉齡50 d 后，豫煙10號(hào)的NtPR1b 表達(dá)量在4 個(gè)烤煙品種中為最高，最早表現(xiàn)出衰老癥狀，而NC89 則衰老表現(xiàn)相對(duì)緩慢。

圖4 不同烤煙品種葉片發(fā)育過程中內(nèi)源激素代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 Variations of relative expressions of genes related to endogenous hormone metabolism during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

3 討論

葉綠素含量下降是煙草葉片衰老的標(biāo)志，其衰老程度越高，降解量越大，并受激素含量的影響[21-22]。在葉齡50 d 后，除NC89 品種外的其他3個(gè)品種葉綠素降解量均開始增加，這與高度衰老特異表達(dá)基因CP1 和CP23 的高表達(dá)研究結(jié)果一致[23-24]。因此，衰老速度快的品種豫煙10 號(hào)激素含量響應(yīng)最早，葉綠素降解量最大，與其衰老基因啟動(dòng)較早有關(guān)。

激素含量的動(dòng)態(tài)變化分析表明，煙葉成熟后期對(duì)衰老起促進(jìn)作用的激素在豫煙10 號(hào)中含量顯著高于NC89。ABA 是一種逆境響應(yīng)調(diào)節(jié)激素[25]，在前期略有干旱時(shí)表現(xiàn)為上升，恢復(fù)正常生長(zhǎng)后下降到正常水平，之后隨著衰老而再次上升，并與GA3表現(xiàn)出相反的變化規(guī)律。一方面說明一定條件下不同品種對(duì)逆境反映出的規(guī)律具有一致性，但品種間存在差異；另一方面說明前期的輕微干旱在灌水后煙株通過自我調(diào)節(jié)能恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，GA3保持較高水平時(shí)煙葉不會(huì)過早進(jìn)入快速衰老狀態(tài)[5]。因此，ABA 和GA3共同調(diào)節(jié)煙葉的衰老進(jìn)程，且有明顯的拮抗作用，這與ABA 生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因NtNCED1 表達(dá)量大幅升高相一致[26]。衰老達(dá)到一定程度后產(chǎn)生乙烯，在植物成熟衰老過程中具有特殊的作用[27]，豫煙10 號(hào)在此階段的NtEFE26 基因表達(dá)量一直保持較高水平，說明其衰老程度較高，這與蔣博文等[28]的研究結(jié)果一致。本研究中發(fā)現(xiàn)，茉莉酸響應(yīng)基因NtPR1b[29-31]與生長(zhǎng)素含量、水楊酸應(yīng)答基因NtCHN50[32]的變化趨勢(shì)相反，說明生長(zhǎng)素、水楊酸與茉莉酸在誘導(dǎo)葉片衰老中表現(xiàn)出相反的功能[33-34]，在調(diào)控?zé)熑~衰老中有明顯的拮抗作用[35-36]，其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

因此，衰老上調(diào)標(biāo)志基因的表達(dá)與促進(jìn)衰老的激素含量動(dòng)態(tài)變化一致，衰老下調(diào)基因與延遲衰老的激素含量動(dòng)態(tài)變化一致，這一關(guān)系與激素的代謝調(diào)控有關(guān)?？赡苁羌に卮x基因控制的內(nèi)源激素含量的改變，通過感知信號(hào)和傳導(dǎo)信號(hào)作用于衰老基因的結(jié)果[37-38]，尚需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

不同烤煙品種成熟衰老特性存在差異，品種間差異與內(nèi)源激素的代謝有關(guān)。成熟落黃快的品種在衰老后期衰老上調(diào)標(biāo)志基因CP1 和CP23 的表達(dá)量較高，具有ABA、乙烯、茉莉酸代謝旺盛的特點(diǎn)；成熟落黃慢的品種則與其相反，具有衰老下調(diào)表達(dá)基因PSA1、MC 的表達(dá)量高，GA3、CTK、IAA和水楊酸代謝旺盛的特點(diǎn)。因此，可依據(jù)不同烤煙品種煙葉衰老特性與內(nèi)源激素含量變化的特點(diǎn)，有效調(diào)控?zé)熑~衰老進(jìn)程和選育具有適宜衰老特性的品種。