結(jié)核患者痰結(jié)核桿菌檢驗的方法分析

陳小冬 葛旭峰*

（荊門市掇刀人民醫(yī)院，湖北 荊門 448000）

結(jié)核病是一種慢性傳染性疾病，是由于結(jié)核桿菌感染所致，機體內(nèi)各個器官均可受到結(jié)核菌的侵入，若未及時治療易損傷患者的腎臟、肺部、肝臟等多個臟腑功能，增加治療難度，使患者的治愈時間延長，使患者的生活質(zhì)量與生存質(zhì)量大幅降低[1]。結(jié)核病早期診斷對于結(jié)核患者的早日康復(fù)轉(zhuǎn)歸具有重要指導意義。目前，臨床結(jié)核患者的常用檢查方法包括痰涂片鏡檢與聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等多種檢驗方法，可為臨床肺結(jié)核臨床診療工作提供準確、快速的臨床診斷，對患者的康復(fù)轉(zhuǎn)歸給予有效指導。因此，我院特選取接受結(jié)核病治療的66例患者入組，分組觀察痰結(jié)核桿菌檢驗的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院接受結(jié)核病治療的66例患者入組，入組時間為2018年2月至2019年2月，采取雙色球分組法分為兩組，對照組及觀察組各33例，對照組中男性18例，女性15例，年齡19～52歲，平均年齡（26.64±3.61）歲，病程5個月～4年，平均病程（2.19±1.62）年；觀察組中男性15例，女性18例，年齡21～50歲，平均年齡（25.79±4.51）歲，病程7個月～4年，平均病程（2.95±1.45）年；兩組患者的臨床資料比較差異P＞0.05，存在統(tǒng)計學意義。

納入標準：①納入患者均在知情自愿且簽訂同意書參與研究，②經(jīng)CT檢查、肺組織活檢、藥敏試驗以及臨床表現(xiàn)等綜合診斷為肺結(jié)核者；③精神系統(tǒng)正常，可閱讀文字，可正常與人溝通交流。排除標準：①排除臨床資料不完整者及未完成檢查者；②排除肝腎等重要臟腑功能損傷者；③排除精神異常者；④排除結(jié)核以外其他傳染性疾?。虎菖懦δ苷系K、腫瘤等血液系統(tǒng)疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 痰液標本：于早晨7～8點收集患者咳出的痰液標本，指導患者晨起深呼吸后咳痰，應(yīng)用專門的痰液收集容器進行收集。若患者無法有效咯出痰液則可通過收集咽拭子標本作為檢驗標準。標本采集完畢后送至實驗室進行痰涂片與PCR檢查。

1.2.2 檢驗儀器與試劑：選用奧林巴斯CX23光學顯微鏡，安捷論Mx3000實時熒光定量RCP儀，均選取儀器配套試劑；選擇微型離心機、高速離心機、微型混勻器、水浴箱、冰箱、干式恒溫箱、生物安全柜等儀器，同時選擇4%氫氧化鈉、石炭酸復(fù)紅染液等試劑。

1.2.3 PCR方法：應(yīng)用PCR法檢驗的觀察組33例具體檢查方法：①收集痰液提取DNA，收集痰液標本與4%的氫氧化鈉放置一起，時間控制為30 min，溫度控制在30 ℃，放置于離心機中進行離心處理，離心時間為5 min，速度為1500 r/min，去上清液后，將沉淀物與生理鹽水混勻并進行離心處理，離心時間為5 min，速度為1000 r/min，重復(fù)上述操作2次，將離心后樣本沉淀物與50 μL NDA提取液充分混合并進行離心處理，離心時間為5 min，速度為1000 r/min，獲取痰液中的DNA。②PCR反應(yīng)，取裝有2 μL的DNA的PCR試管35份，離心處理時間為10 s，速度為8000 r/min。預(yù)變性處理時，溫度加熱至93 ℃，加熱時間為2 min，將DNA分解為單鏈，控制溫度為55 ℃，使單鏈DNA分子與引物以互補序列配對方式結(jié)合，在Taq酶作用下，引物結(jié)合物中的脫氧核糖核苷三磷酸作為反應(yīng)原料，模板為靶序列，延伸原理是堿基配對和半保留原理，形成1條與模板DNA鏈互補的新半保留復(fù)制鏈，過程中應(yīng)控制溫度在72 ℃，1 min后可形成一個新DNA片段，設(shè)置循環(huán)數(shù)為40個，終止反應(yīng)，結(jié)核桿菌DNA含量則由儀器進行自動計算。

1.2.4 痰涂片鏡檢方法：應(yīng)用痰涂片鏡檢的對照組33例具體檢查方法：用鑷子將酒精浸泡的玻璃片取出，放置于酒精燈火焰上進行烘干處理，使載玻片上的油脂、酒精等有效清除，待載玻片溫度降至室溫偶，將收集的痰液用燒灼放冷的接種環(huán)于載玻片上均勻涂抹，染色方法為齊-尼氏抗酸染色法[2]，用生物顯微鏡進行鏡檢。涂片鏡檢中應(yīng)注意：應(yīng)控制標本涂層厚度，不可涂太厚以免無法觀察到單個菌體，不可涂太薄以免無法找到生物組織，涂片時也應(yīng)控制涂片力度，以免用力過猛導致載玻片菌體受到破壞。熱固定時涂片后應(yīng)使標本完全風干，標本通過火焰快速烘干次數(shù)應(yīng)控制3～4次。熱固定的目的在于有效殺滅微生物，提高菌體染色度，有利于微生物黏附在載玻片上。痰涂片鏡檢陽性檢出標準：若在100視野中抗酸桿菌數(shù)量在3～9個，提示結(jié)核桿菌陽性[3]。

1.3 統(tǒng)計學處理：選用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以t值檢驗并用（±s）描述，計數(shù)資料以χ2值檢驗并用（%）描述，P值＜0.05時則存在統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

觀察組應(yīng)用PCR法檢驗陽性檢出率為78.79%，對照組應(yīng)用痰涂片鏡檢的陽性檢出率為24.24%，兩組數(shù)據(jù)比較觀察組明顯高于對照組，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組痰液樣本檢驗結(jié)果[n（%）]

3 討論

結(jié)核病是臨床常見傳染性疾病，具有臨床癥狀輕微、發(fā)病緩慢、病程期較長等特點。經(jīng)臨床調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核病的主要發(fā)病人群為青年人。感染結(jié)核桿菌后，潛伏期在4～8周，其中肺部感染結(jié)核桿菌者約占80%，其中侵入皮膚、骨骼、腹膜、腦膜、頸淋巴等處的發(fā)生率約占20%。傳染方式主要是通過人呼吸道傳染，而直接或間接接觸正在排菌的肺結(jié)核患者是主要傳染源。結(jié)核桿菌經(jīng)呼吸道進入機體后易誘發(fā)結(jié)核病，對患者的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴細胞均會造成嚴重損害，也會損害患者的器官功能，嚴重影響患者的日常生活與工作。結(jié)核桿菌誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的風險較高，具有一定的傳染性，病情較輕者可出現(xiàn)體溫上升，渾身乏力，惡心嘔吐、食欲不振等癥狀，嚴重者也會出現(xiàn)上腹部疼痛、反復(fù)高熱、咳痰咯血等癥狀，降低患者生活質(zhì)量的同時，也會威脅患者的生命安全。若結(jié)核患者未能及時接受有效治療，病灶也會轉(zhuǎn)移至肝腎等臟腑，增加患者在治療過程中花費的時間與精力，也會降低患者的治愈信心，影響患者的康復(fù)轉(zhuǎn)歸。隨著我國醫(yī)療事業(yè)的前足發(fā)展，人們對結(jié)核病的重視程度進一步加大，臨床結(jié)核病治療獲得了較大成果，但是結(jié)核發(fā)病率仍呈逐年升高狀態(tài)，威脅著人們的生命安全。結(jié)核患者發(fā)病早期無明顯癥狀，早期診斷難度較大，易延誤病情，延長患者的治愈時間，使得患者在致病菌影響下降低身體功能，引起疾病轉(zhuǎn)移，甚至進一步惡化，使患者的治療難度進一步增大。因此，早期診斷及時開展有效治療是阻止疾病進一步發(fā)展，促進疾病康復(fù)轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在。

結(jié)核病主要是通過空氣傳播，為了有效控制結(jié)核病流行傳播，加強病原體通過空氣傳播則是預(yù)防此病的重點環(huán)節(jié)，可通過以下環(huán)節(jié)預(yù)防結(jié)核病傳播，首先，養(yǎng)成良好的生活衛(wèi)生習慣，已確定患有結(jié)核病的患者應(yīng)做好痰液傳播防護措施，不可隨意吐痰，做好衛(wèi)生消毒工作，加強個人衛(wèi)生防護。結(jié)核患者居住地也應(yīng)定期消毒通風，增加室內(nèi)的空氣流通，減少空氣中結(jié)核桿菌的數(shù)量。結(jié)核患者也應(yīng)勤更換衣服，勤洗澡，保證個人衛(wèi)生。其次，定期開展個人健康檢查，結(jié)核病的治療關(guān)鍵是早期發(fā)現(xiàn)，所以，可定期開展肺部X線檢查、早晨痰液檢查等方式，及時發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病，早期治療，以免病情進一步發(fā)展惡化。最后，新生兒可通過接種卡介苗預(yù)防肺結(jié)核，目前我國新生兒卡介苗的接種率高達100%，同時嬰幼兒與適齡兒童的預(yù)防接種的查漏補種工作也持續(xù)開展，可有效提高嬰幼兒人群對結(jié)核病的免疫力，逐漸提升我國國民整體免疫力。結(jié)核病臨床治療時會給機體造成諸多負面影響，選擇適當?shù)臋z驗方法進行早期診斷，制定行之有效的治療方案，可縮短患者的治療時間，減輕患者的經(jīng)濟負擔，因此，選擇一種科學的痰結(jié)核桿菌檢驗方法具有重要意義。

以往臨床結(jié)核檢驗多采取痰液涂片鏡檢，此種方法操作簡單，檢測費用相對較低。結(jié)核病患者的病程期較長，痰菌轉(zhuǎn)陰率是臨床判斷治療及預(yù)后效果的重要指標，對患者的機體功能恢復(fù)具有積極促進意義。結(jié)核桿菌作為臨床診斷的重要指標，可通過痰液涂片抗酸染色法、痰培養(yǎng)法等方式進行常規(guī)檢查，但是，痰液涂片鏡檢需要痰液樣本的質(zhì)量要求較高，檢測的靈敏度較低，陽性檢出率較低，嚴重影響患者的機體恢復(fù)，降低預(yù)后效果。

隨著臨床研究的深入發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)在結(jié)核臨床檢驗中得到有效應(yīng)用，通過利用聚合酶鏈式反應(yīng)基因擴增儀使DNA片段放大擴增，獲取性質(zhì)穩(wěn)定的結(jié)核桿菌DNA進行臨床檢測。檢驗過程中可通過提取痰液樣品中的DNA，選擇寡核苷酸進行結(jié)核桿菌DNA基因擴增的引物，使所提取的DNA提取物中是否含有目標檢測的結(jié)核桿菌DNA得以明確，使臨床檢測的準確性與可靠性大幅升高。應(yīng)用PCR反應(yīng)對結(jié)核患者進行檢驗可使臨床檢測的準確性、可靠性大幅升高，為臨床診斷提供準確且及時的診斷依據(jù)，為臨床后續(xù)治療工作的開展提供指導依據(jù)。

PCR作為現(xiàn)階段新興分子與基因結(jié)合診斷方法，具有診斷速度快、費用低廉、特異性高等特點。經(jīng)臨床相關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，應(yīng)用PCR檢查肺結(jié)核合并人類免疫缺陷病毒群體的敏感率可達到95%，準確率為94%，與常規(guī)實驗室診斷結(jié)果相比存在明顯差異（P＜0.05）；此研究結(jié)果側(cè)面證明了結(jié)核病應(yīng)用PCR診斷時，人類免疫缺陷病毒感染無法對檢查結(jié)果造成感染。本組研究中觀察組應(yīng)用PCR檢查，對照組應(yīng)用痰液涂片鏡檢，觀察組的陽性檢出率明顯高于對照組（P＜0.05）；因此，相比于痰液涂片鏡檢而言，結(jié)核患者應(yīng)用PCR檢查的陽性檢出率較高，檢查效果較佳，可助于醫(yī)師對患者病情進展進行全面評估，可為臨床治療提供強有力的保障。

綜上所述，結(jié)核患者應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)可使陽性檢出率大幅提升，為臨床診療工作提供科學指導依據(jù)，對于治療及預(yù)后效果也具有良好的評價效果。因此，聚合酶鏈式反應(yīng)值得在臨床結(jié)核病臨床診斷中進一步推廣普及。