奈達(dá)鉑在微電化學(xué)池中的電化學(xué)測定研究

趙建松，丁崗芯，貝玉祥，李國達(dá)，熊華斌，李曉芬，高云濤

(1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國際聯(lián)合研究中心，昆明 650500；2.昆明貴研藥業(yè)有限公司，昆明 650106)

奈達(dá)鉑(Nedaplatin，NDP)，化學(xué)名為順式-乙醇酸-二氨合鉑，是繼順鉑、卡鉑后第三代鉑類抗腫瘤藥物。主要用于食管癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌的治療，是我國和亞洲應(yīng)用廣泛的抗腫瘤藥[1-5]。其療效與順鉑相當(dāng)或更優(yōu)，具有治療指數(shù)高、腎和胃腸道毒性低、使用方便、不需水化等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的NDP 分析方法僅見高效液相色譜法一種[9-13]。電化學(xué)方法具有響應(yīng)迅速、低成本、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，能夠幫助研究者更好地完成對(duì)鉑族藥物進(jìn)行原位、在線、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)等復(fù)雜的分析任務(wù)，獲得更多的生理生化信息[14-17]。已有研究表明鉑族抗癌藥物具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，并據(jù)此建立了卡鉑[18]、順鉑[19]、甲啶鉑[20]等的電化學(xué)測定方法。

隨著新材料、新器件和新方法在電極和傳感器系統(tǒng)中的發(fā)展，電化學(xué)分析在藥物質(zhì)量控制、代謝研究、作用機(jī)理和毒害物質(zhì)分析等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[21]。絲網(wǎng)印刷電極(Screen Printed Electrode)具有結(jié)構(gòu)小巧、集成度高、成本低、可批量生產(chǎn)等特點(diǎn)，因其前處理簡單，使用方便，在藥物、代謝產(chǎn)物和降解物分析中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[22-30]。近年來，研究者致力于應(yīng)用絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)建小型化、便攜式的在線微量分析系統(tǒng)，可應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)多種介質(zhì)中微小量樣品(20～100 μL)的快速分析，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[31-34]。

本文基于絲網(wǎng)印刷電極的特點(diǎn)設(shè)計(jì)和制作了一種新型的微電化學(xué)池裝置，研究了NDP 在微電化學(xué)池中的電化學(xué)行為，建立了NDP 的電化學(xué)微量快速測定新方法，并將其應(yīng)用于NDP 生產(chǎn)線樣品的在線快速電化學(xué)分析，為鉑族藥物分析提供了一種新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI650E 型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；DRP-110 絲網(wǎng)印刷電極(瑞士萬通有限公司)，電極為陶瓷基底，工作電極和對(duì)電極為碳漿、參比電極為銀/氯化銀漿印制，三電極呈直徑為7 mm 的圓形區(qū)域；絲網(wǎng)印刷電極連接線；1.5 mL 圓底聚丙烯離心試管；紫外光膠(配備紫外燈)。

NDP 標(biāo)準(zhǔn)品(白色粉末狀，含量≥99.0 %，昆明貴研藥業(yè)有限公司)，用pH=7.4 的0.1 mol/L 氯化銨溶液溶解，配制為1 mg/mL 的貯備液，于4℃避光密封保存，使用前用0.1 mol/L 的氯化銨溶液稀釋為一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。NDP針劑(固體，規(guī)格：10 mg，江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司)。NDP 生產(chǎn)線初產(chǎn)品(白色晶體，昆明貴研藥業(yè)有限公司)。氯化銨、醋酸鈉、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀等均為優(yōu)級(jí)純(GR)試劑，純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))≥99.8%。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 絲網(wǎng)印刷電極基微電化學(xué)池制備

本文設(shè)計(jì)的絲網(wǎng)印刷電極基微電化學(xué)池裝置包括絲網(wǎng)印刷電極基片和半圓狀槽體兩部分，裝置如圖1 所示。絲網(wǎng)印刷電極采用瑞士萬通有限公司市售的DRP-110 絲網(wǎng)印刷電極，具有尺寸合適圓形三電極區(qū)。半圓狀槽體采用1.5 mL 圓底聚丙烯離心試管沿中線垂切開制得，其圓形部分略大于絲網(wǎng)印刷電極三電極區(qū)。將半圓狀槽體切面圓形部分正對(duì)于絲網(wǎng)印刷電極的圓形三電極區(qū)，外緣與電極基片用紫外光膠粘合，即可制得一半圓柱狀體的絲網(wǎng)印刷電極基微電化學(xué)池裝置。本法所制備的微電化學(xué)池相對(duì)于微流控芯片、紙基微電極等已有的絲網(wǎng)印刷電極基電化學(xué)池裝置而言，具有制作簡單快速，材料易得，成本低廉，可拋棄式使用等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 微電化學(xué)池構(gòu)建圖Fig.1 Miniature electrochemical reaction cell construction diagram

1.3 電極活化

使用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確移取100 μL 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液于微電化學(xué)池中，在電位范圍-0.8～1.0 V、掃描速度0.05 V/s、掃描段數(shù)2、采樣間隔0.001 V 的條件下循環(huán)伏安法掃描30 次，用去離子水洗凈，風(fēng)干備用。

1.4 電化學(xué)測定

微電化學(xué)池豎直固定，將其用絲網(wǎng)印刷電極連接線與電化學(xué)工作站相連接，使用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確移取100 μL 待測試溶液于微電化學(xué)池中，進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)和差分脈沖伏安(DPV)測定。其中，CV 測定參數(shù)為：電位范圍-0.8～1.0 V、掃描速度0.05 V/s；DPV 測定參數(shù)為：電位范圍-0.2～1.2 V、脈沖寬度0.04 V、電位增量0.005 V、振幅0.05 V、脈沖周期0.9 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 微電化學(xué)池性能分析

用電化學(xué)工作站進(jìn)行測定時(shí)，當(dāng)微電化學(xué)池溶液體積達(dá)到0.1 mL，即可完全覆蓋三電極區(qū)域。以0.05 mol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1:1)，0.1 mol/L KCl 作為電化學(xué)探針溶液，在微電化學(xué)池上進(jìn)行電化學(xué)性能測試，并使用常規(guī)電化學(xué)池(相同電極，溶液量20 mL)進(jìn)行對(duì)比測試，結(jié)果如圖2 所示，得到的分析性能參數(shù)列于表1。

圖2 微電化學(xué)池和常規(guī)電化學(xué)池的循環(huán)伏安圖和差分脈沖伏安曲線Fig.2 The CV curves (a) and DPV curves (b) of miniature electrochemical reaction cell and conventional electrochemical cell

表1 分析性能測定結(jié)果(n=5)Tab.1 Analytical performance measurement results (n=5)

從圖2 中可以看出，微電化學(xué)池對(duì)探針溶液較常規(guī)電化學(xué)池具有更好的電化學(xué)響應(yīng)，并在一定程度上改善了對(duì)探針溶液CV 和DPV 的測試性能。根據(jù)表1 所示結(jié)果，與常規(guī)電化學(xué)池相比，微電化學(xué)池的氧化峰電位(Epa)與還原峰電位(Epc)之比變小，氧化峰電流(Ipa)與還原峰電流(Ipc)之比更接近1，說明微電化學(xué)池中的電化學(xué)反應(yīng)可逆性更好；從DPV測定結(jié)果看，Ipa值較常規(guī)電化學(xué)池明顯增加，更重要的是，微電化學(xué)池的測試相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值比常規(guī)電化學(xué)池更低，表明相同條件下微電化學(xué)池具有更高的測試精密度。

2.2 支持電解質(zhì)及其酸度的影響

條件試驗(yàn)中以醋酸-醋酸鈉溶液、PBS 緩沖溶液、氯化鉀溶液和氯化銨溶液作為支持電解質(zhì)進(jìn)行對(duì)比測定。結(jié)果表明：NDP 在0.1 mol/L 的氯化銨溶液中呈現(xiàn)出一對(duì)明顯的氧化還原峰，峰形較好，且峰電流值與其濃度呈正比關(guān)系。選擇0.1 mol/L的氯化銨溶液作為支持電解質(zhì)。

進(jìn)一步探究了pH 值對(duì)NDP 電化學(xué)行為的影響。pH 值在5.5～8.5 范圍內(nèi)，Epa和Epc均隨pH 值的增加而逐漸負(fù)移，說明在該pH 范圍內(nèi)NDP 在微電化學(xué)池中的電化學(xué)行為受H+質(zhì)子的影響較大。Ipa值隨pH 值的增加而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在pH=7.4 左右達(dá)到最大值，且峰形最好。因此，最佳pH 值為7.4。

在優(yōu)化條件下對(duì)NDP 進(jìn)行CV 測定，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可見，向空白底液(0.1 mol/L 氯化銨溶液，pH=7.40，虛線)加入NDP 溶液后，出現(xiàn)一對(duì)明顯的準(zhǔn)可逆氧化還原峰(實(shí)線)，Epa和Epc分別為0.61 V 和0.02 V，氧化還原峰電位差(?E)為0.57 V，Ipa與Ipc的比值為2.03。

圖3 奈達(dá)鉑在微電化學(xué)池中的循環(huán)伏安圖Fig.3 The CV curves of nedaplatin in miniature electrochemical reaction cell

2.3 掃描速度的影響

在微電化學(xué)池中加入100 μL 一定濃度的NDP標(biāo)準(zhǔn)溶液，探究了掃描速度(v)在0.01～0.1 V/s 范圍內(nèi)對(duì)NDP 電化學(xué)行為的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 奈達(dá)鉑在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.4 The CV curves of nedaplatin at different scan rate

由圖4 可見，Ipa和Ipc隨著v的增加而均勻增加，Epa正移，Epc負(fù)移，且Ipa與Ipc均與v的平方根成正比，其線性關(guān)系分別為：

上述結(jié)果表明，在0.01～0.1 V/s 的掃速范圍內(nèi)，NDP 在微電化學(xué)池電極表面的氧化和還原過程是準(zhǔn)可逆過程，在此范圍內(nèi)受擴(kuò)散控制。大量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)掃速在0.05 V/s 時(shí)，CV 測定的峰形最佳，重現(xiàn)性好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的掃速為0.05 V/s。NDP 的峰電流(Ip)與v成線性關(guān)系，根據(jù)Laviron 理論，有如下關(guān)系式：

式中，n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn) 為法拉第常數(shù)，A為電極表面積，T為298 K，R 為摩爾氣體常量，Q=nFAT為循環(huán)伏安單一過程的峰面積(以電量計(jì))。由上式可知，在一定掃數(shù)下，通過計(jì)算NDP 的峰面積，可得出參與電子反應(yīng)的電子數(shù)。因此當(dāng)v=0.05 V/s時(shí)，不同濃度NDP 參與電極反應(yīng)的電子數(shù)約等于2。

2.4 分析性能及干擾試驗(yàn)

按照1.4 操作，用微電化學(xué)池對(duì)NDP 進(jìn)行DPV定量分析，測定了不同濃度的NDP 在微電化學(xué)池中的氧化峰，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同濃度奈達(dá)鉑的差分脈沖曲線圖Fig.5 The DPV curves of nedaplatin at different concentrations

根據(jù)圖5 數(shù)據(jù)，NDP 的Ipa值與其濃度(c)在0.4×10-2～1.2×10-2mg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Ipa=-284.57c+0.0329 (R2=0.9995)，檢出限(3s/b)為3.97×10-4mg/mL。

干擾試驗(yàn)表明，當(dāng)干擾水平為5%時(shí)，3 倍的Pt(II)，100 倍的K+、Na+、Ca+、Mg2+和NO3-、SO42-、Cl-，10 倍的Fe3+、Co2+和Ni2+，20 倍Cu2+、Pb2+和Cd2+不干擾測定結(jié)果。

2.5 樣品測定

模擬注射液使用江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射劑固體，按照臨床注射使用方法，用生理鹽水配制為0.80×10-2mg/mL 的模擬注射液。生產(chǎn)線樣品取自昆明貴研藥業(yè)有限公司NDP 合成生產(chǎn)線待包裝的晶體，用生理鹽水溶解配制為0.80×10-2mg/mL生產(chǎn)線樣品測試溶液。兩種樣品測定前用0.1 mol/L 氯化銨溶液(pH=7.4)稀釋至一定濃度，根據(jù)1.4 項(xiàng)所述方法進(jìn)行DPV 的測定，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與液相色譜方法進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如表2 所列。

表2 實(shí)際樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果(n=5)Tab.2 Measurement result of actual samples by recovery experiment (n=5)

根據(jù)表2 的結(jié)果，測得模擬注射液和生產(chǎn)線樣品的RSD在1.38%～2.18%之間，加標(biāo)回收率在97.4%～ 103.8%范圍之間，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。樣品濃度的測定平均值與液相色譜法的結(jié)果相近，因此本法可以用于生產(chǎn)、臨床使用等過程中NDP 的定量快速在線測定。

3 結(jié)論

1) 用市售絲網(wǎng)印刷電極和圓底聚丙烯離心試管制作得到微電化學(xué)池。該微電化學(xué)池試液容量為0.1 mL，制作簡便，材料易得，成本低廉。

2) 研究了抗癌藥奈達(dá)鉑(NDP)在微電化學(xué)池中的電化學(xué)特性，考察酸度、支持電解質(zhì)和掃描速率對(duì)循環(huán)脈沖和差分脈沖曲線的影響，結(jié)果表明微電化學(xué)池對(duì)探針溶液較常規(guī)電化學(xué)池具有更好的電化學(xué)響應(yīng)。

3) 采用差分脈沖方法進(jìn)行NDP 的定量測定。NDP 濃度0.4×10-2～1.2×10-2mg/mL 范圍內(nèi)，與Ipa值內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，測定結(jié)果與液相色譜法測定結(jié)果相當(dāng)。

4) 這一技術(shù)可用于企業(yè)生產(chǎn)、臨床用藥等過程中NDP 的定量快速測定，亦可用于其它鉑類藥物生產(chǎn)和使用過程中的快速在線分析，并有望拓展到環(huán)境、生物等領(lǐng)域的貴金屬及稀有金屬的微量快速測定。