淫羊藿葉HPLC指紋圖譜的建立及2個(gè)化學(xué)成分含量的測(cè)定

曹菁，王淑敏，宋鳳瑞，皮子鳳

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022；3.中藥化學(xué)與質(zhì)譜吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicomu Maxim.）、箭葉淫羊藿 [Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.]、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens Maxim.）或朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai）的干燥葉[1]，味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)。其功能是強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、補(bǔ)腎陽(yáng)[2]，用于治療腎陽(yáng)虛衰，陽(yáng)痿遺精，筋骨痿軟[3-6]，并且對(duì)于增強(qiáng)心臟功能和抗腫瘤方面也具有一定療效[7-8]。淫羊藿主要有效成分是黃酮類和多糖類[9]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有促進(jìn)作用[10]，且其含有的黃酮類成分（淫羊藿苷、朝藿定C、寶藿苷I等）抗炎鎮(zhèn)痛作用突出[11]。中藥提取液化學(xué)成分種類多且復(fù)雜，其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)逐步由測(cè)定單一化學(xué)成分含量變?yōu)闇y(cè)定多組分化學(xué)成分含量。本研究擬建立淫羊藿葉指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上，測(cè)定淫羊藿苷的含量，同時(shí)增加淫羊藿次苷I含量的測(cè)定[12]，雙指標(biāo)成分含量測(cè)定不僅可提高淫羊藿葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)水平，也可為后續(xù)淫羊藿葉藥理有效成分的研究奠定基礎(chǔ)。

1 主要儀器與材料

1.1 主要儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；G10S UV-Vis 型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；KQ-250DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D 型天平（德國(guó)賽多利斯公司）；98-1-B 型電子控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料

1.2.1 試劑 色譜級(jí)甲醇、乙腈和甲酸（美國(guó)Fishers公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2.2 試藥 淫羊藿苷（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：190607）；淫羊藿次苷I（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：190730）。

1.2.3 飲片來(lái)源 淫羊藿藥材購(gòu)于遼寧省新賓市、遼寧省桓仁縣和吉林省通化市，每個(gè)產(chǎn)地5 批次藥材，共15 個(gè)批次，編號(hào)分別是S1～S15，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所質(zhì)譜中心皮子鳳副研究員鑒定為淫羊藿（Epimedium brevicomu Maxim.）葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取淫羊藿苷，用適量甲醇制成0.8 mg/mL 的淫羊藿苷溶液；取淫羊藿次苷I，用適量甲醇制成0.1 mg/mL的淫羊藿次苷I 溶液。

2.2 供試品溶液的制備

選用淫羊藿葉100 g，采用回流法提取2 次，第1次加入12 倍水，放置30 min，回流提取30 min，過(guò)200目濾布，濾液備用；藥渣第2次加入10倍水，提取20min，過(guò)200 目濾布，合并2 次濾液，減壓濃縮至500 mL，凍干備用。取凍干粉0.3 g，加入20 mL水超聲提?。üβ?00 W，頻率 40 kHz）60 min，放至室溫，搖勻，過(guò) 0.45m 的微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：采用YMC-PackODS-A（4.6mm 250mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：梯度洗滌程序見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10L。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2.4 空白溶劑干擾考察

將乙腈作為空白溶劑，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件開(kāi)始檢測(cè)。空白溶劑對(duì)淫羊藿葉指紋圖譜不造成干擾，結(jié)果如圖1 所示。

2.5 對(duì)照品和供試品峰比對(duì)

將“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，用高效液相色譜儀檢測(cè)。結(jié)果顯示所選藥材中含有淫羊藿苷、淫羊藿次苷I。淫羊藿苷對(duì)照品色譜圖如圖2 所示；淫羊藿次苷I 對(duì)照品色譜圖如圖3 所示，供試品色譜圖如圖4 所示。

圖1 空白溶劑色譜Fig.1 Blank solvent chromatogram

圖2 淫羊藿苷對(duì)照品色譜Fig.2 Icariin reference substance chromatogram

圖3 淫羊藿次苷I 對(duì)照品色譜Fig.3 Icarisid I reference substance chromatogram

圖4 供試品色譜Fig.4 Test product chromatogram

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下的淫羊藿苷對(duì)照品溶液和淫羊藿次苷I 對(duì)照品溶液，加適量甲醇制成每 1 mL含 800、400、200、100、50、25g 的淫羊藿苷對(duì)照品溶液；加適量甲醇制成每1 mL 含100、50、25、12.5、6.25、3.125g 的淫羊藿次苷I 對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件，用高效液相色譜儀檢測(cè)，含量作為X軸，峰面積作為Y軸，得到淫羊藿苷的回歸方程為Y=3E+08X+2E+0.6，r=0.999 7，線性范圍為 25～800g，淫羊藿次苷 I 的回歸方程為 Y=3E+08X+82 478，r=0.999 3，線性范圍為 3.125～100g，兩者均線性良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按照“2.3”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜1%，相對(duì)峰面積的RSD 值＜3%，供試驗(yàn)用儀器具有良好的精密度，結(jié)果如表2、3所示。

表2 淫羊藿葉精密度試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果Table 2 Results of relative retention time of epimedii leaves in precision test

表3 淫羊藿葉精密度試驗(yàn)的相對(duì)峰面積結(jié)果Table 3 Results of relative peak area of epimedii leaves in precision test

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，在0、2、5、8、14、18、24 h依次測(cè)定，8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜2%，相對(duì)峰面積RSD 值＜3%，證明該溶液24 h 內(nèi)化學(xué)成分穩(wěn)定，結(jié)果如表 4、5 所示。

表4 淫羊藿葉穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果Table 4 Results of relative retention time of epimedii leaves in stability test

表5 淫羊藿葉穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)峰面積結(jié)果Table 5 Results of relative peak area of epimedii leaves in stability test

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下確定的供試品制作方式制作6 份，分別按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，分析說(shuō)明8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值＜1%，相對(duì)峰面積的RSD 值＜3%，重復(fù)性良好，結(jié)果如表6、7 所示。

表6 淫羊藿葉重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果Table 6 Results of relative retention time of epimedii leaves in repeatability test

2.7 淫羊藿葉中已知成分含量測(cè)定

按照“2.2”項(xiàng)下的方法，制備15 批次淫羊藿葉的供試品溶液；取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品適量，用適量甲醇稀釋成每1 mL 含0.4 mg 的淫羊藿苷、0.06 mg 的淫羊藿次苷I溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，分別用高效液相色譜儀檢測(cè)，結(jié)果如表8 所示。

2.8 指紋圖譜建立及分析

2.8.1 指紋圖譜的建立 將“2.1”項(xiàng)下的2 個(gè)對(duì)照品溶液等比混合，制成的混合對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，使用高效液相色譜儀檢測(cè)。所得淫羊藿葉HPLC 對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖5、15批次淫羊藿葉色譜疊加圖見(jiàn)圖6。

表8 淫羊藿葉中淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 的含量測(cè)定結(jié)果Table 8 Content determination results of icariin and icarisid I in epimedii leaves

圖5 淫羊藿葉與混合對(duì)照品溶液指紋圖譜對(duì)比Fig.5 Fingerprint comparison of epimedii leaves and mixed control solution

圖6 15 批次淫羊藿葉HPLC 圖譜Fig.6 HPLC spectrum of 15 batches of epimedii leaves

由圖5 可知，該指紋圖譜找到8 個(gè)共有峰，與對(duì)照品色譜圖對(duì)比確認(rèn)6 號(hào)峰為淫羊藿苷，7 號(hào)峰為淫羊藿次苷I，并將6 號(hào)峰（淫羊藿苷）定為參照S 峰。

2.8.2 相似度分析 依據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版），采用中位數(shù)法依次進(jìn)行15 批次淫羊藿葉指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)，S1～S15 相似度分別為0.998，0.996，0.996，0.992，0.987，0.991，0.994，0.996，0.998，0.992，0.998，0.992，0.987，0.987，0.993。

15 批次淫羊藿葉指紋圖譜整體相似度為0.986～0.999，均大于0.9，具有較高的一致性。

2.8.3 聚類分析 將15 批次淫羊藿葉的8 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0，運(yùn)用平均歐式距離法，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 淫羊藿葉聚類分析Fig.7 Cluster analysis of epimedii leaves

由圖7 可知，15 批次淫羊藿葉共分為兩大類，即S11 單獨(dú)列為第一類，其他批次歸為第二類，第二類又可細(xì)分為 3 個(gè)小分類，即 S1、S5、S9、S11、S14、S15 為第一小分類；S3、S4、S7、S8、S10 為第二小分類；S2、S6、S12、S13 為第三小分類。分類結(jié)果表明不同產(chǎn)地淫羊藿藥材在分類距離上較遠(yuǎn)，即使同一產(chǎn)地其分類距離也存在明顯差異性。初步分析，可能與淫羊藿藥材采摘時(shí)間、貯存方式和氣候等有關(guān)。15 批次淫羊藿葉在產(chǎn)地和批次上主化學(xué)成分種類具有代表性，指紋圖譜能夠反映出樣品的全貌。

3 討論

（1）中藥提取物所含化學(xué)成分十分復(fù)雜，研究難度較大[13-14]，但中藥指紋圖譜恰好可以全方面反映藥材多組分全貌，指紋圖譜也被視為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的常用方法之一[15-18]。因此，建立淫羊藿葉指紋圖譜具有重大的意義，不僅可以規(guī)范其整體質(zhì)量，而且可為其后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

（2）在該試驗(yàn)對(duì)于供試品的前處理方法中，比較了不同提取溶劑和提取方式兩方面對(duì)淫羊藿葉指紋圖譜的影響。在提取溶劑方面，選取了水、60%甲醇、稀乙醇3 種溶劑作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿凍干粉在稀乙醇中溶解性不好，在水和60%甲醇中溶解性較好，但是以60%甲醇作提取溶劑的色譜圖無(wú)論在出峰數(shù)目還是在分離度上均優(yōu)于以水作為溶劑的色譜圖，因此選擇60%甲醇作為提取溶劑。在提取方式方面，選擇了超聲提取法和回流提取法2 種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種方法提取的淫羊藿葉色譜圖差別很小，但是超聲提取方法更加簡(jiǎn)便，因此選擇超聲方法作為提取方法。

（3）該試驗(yàn)對(duì)于色譜條件的確定，考察了色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相系統(tǒng)、流速、柱溫五方面對(duì)淫羊藿葉指紋圖譜的影響。在色譜柱方面，選了Shim-Pack XRODS Ⅲ（2.0 mmi.d 150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm 150 mm, 5m) 和YMC-Pack ODS-A（4.6 mm 250 mm，5m）3 個(gè)色譜柱，結(jié)果表明樣品在Agilent Zorbax SB-C1（84.6 mm 150 mm,5m）和Shim-Pack XR-ODS Ⅲ（2.0 mmi.d 150 mm）中不能達(dá)到分離要求，而在YMC-PackODS-A（4.6mm 250mm，5m）色譜柱中不僅出峰快、數(shù)目多，而且分離度符合要求，所以選擇YMC-Pack ODS-A）4.6 mm 250 mm，5m）色譜柱作為該試驗(yàn)色譜柱。在檢測(cè)波長(zhǎng)方面，用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）中200～400 nm 依次掃描2 個(gè)對(duì)照品溶液和供試品溶液，結(jié)果顯示在270 nm處3 個(gè)樣品均有最大吸收，色譜圖信息豐富，淫羊藿苷和淫羊藿次苷I 峰高較高，所以選用270 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相系統(tǒng)方面，研究不同種類有機(jī)相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（水、0.1%甲酸水溶液）構(gòu)成的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)供試品溶液色譜峰分離的影響。篩選乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，甲醇-0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)不利于樣品的洗脫，出峰數(shù)目稀少且分離度不好，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)其色譜峰和色譜峰的對(duì)稱性均優(yōu)于乙腈-水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，所以確定該流動(dòng)相系統(tǒng)作為該試驗(yàn)檢測(cè)的流動(dòng)相。在流速方面，選擇 0.8、1.0、1.2 mL/min 3 種流速進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，用0.8 mL/min 流速檢測(cè)色譜峰出峰不完全，用1.2 mL/min流速檢測(cè)色譜峰分離度不好，用1.0mL/min流速檢測(cè)色譜峰出峰數(shù)目完全，分離度較好，所以確定流速為 1.0 mL/min。在柱溫方面，對(duì) 25 ℃、30 ℃、35 ℃3 種柱溫進(jìn)行篩選，結(jié)果表明升高柱溫，分離效果變差，因此確定25 ℃作為檢測(cè)柱溫。

（4）15 批次淫羊藿葉指紋圖譜整體相似度為0.986～0.999，大于 0.9，相似度良好，15 批淫羊藿中淫羊藿苷含量的RSD 值是0.18%、淫羊藿次苷I 含量的RSD值是0.14%，表明二者含量均沒(méi)有明顯差異，但是聚類分析結(jié)果將15 批次淫羊藿葉分為4 類，且8 個(gè)共有峰峰面積的RSD值在7%～58%，說(shuō)明淫羊藿苷和淫羊藿次苷I 的含量對(duì)其整體含量變化影響很小，其他化學(xué)成分含量變化起主要作用，初步分析應(yīng)該與淫羊藿中草藥產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采摘時(shí)間、放置條件和放置時(shí)間等有關(guān)。

（5）本研究運(yùn)用高相液相色譜分析法，建立了淫羊藿葉的指紋圖譜，該指紋圖譜可以全面展現(xiàn)淫羊藿葉化學(xué)成分的特點(diǎn)，適用于因產(chǎn)地、批次和生長(zhǎng)環(huán)境等因素不同，出現(xiàn)的質(zhì)量不均一的淫羊藿葉。該方法簡(jiǎn)便易行[19]，指紋峰分離度好，具有較高的可信度，為后續(xù)淫羊藿葉的研究開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)[20]。