三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性研究

湯紅，張鴻，張定平，龍?jiān)戮辍?，毛忠?/p>

(1.文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院三七學(xué)院，云南 文山 663099；3.文山學(xué)院三七研究院，云南 文山 663099)

三七黑斑病是三七的主要葉部病害之一，在三七產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，通常發(fā)病率為25%～35%，防治不當(dāng)可高達(dá)90%[1]，每年5 月、7～9 月是病害嚴(yán)重暴發(fā)的高峰期，當(dāng)日平均氣溫達(dá)18 ℃以上，空氣相對(duì)濕度達(dá)65%以上，連續(xù)小雨2～3 d 或日降雨量達(dá)15 mm 以上時(shí)，常暴發(fā)黑斑病，并且發(fā)病率隨著降雨次數(shù)和降雨量的增加而上升[2]。三七黑斑病病原主要通過侵染三七葉片部位引發(fā)病害，其莖、花軸及果柄的幼嫩部位均可受害，對(duì)三七的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。目前，對(duì)三七黑斑病主要采用化學(xué)防治，但對(duì)殺菌劑的過分依賴和用量的不斷增加，較易造成三七農(nóng)藥殘留超標(biāo)，品質(zhì)下降，也使得該病害對(duì)一些常用殺菌劑的敏感性下降。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 50 個(gè)供試菌株分離自云南省硯山、石林、西雙版納和丘北等不同三七種植基地且具有典型癥狀的三七黑斑病病樣，經(jīng)鑒定為三七黑斑病菌Alternaria panax Whetz。

1.1.2 供試藥劑 烯唑醇原藥由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性測(cè)定 參照徐建強(qiáng)等[11]方法進(jìn)行，將供試菌株在無菌PDA 平板上20 ℃培養(yǎng) 7 d，用打孔器（=5 mm）在菌落邊緣打取菌餅，設(shè)置含藥 PDA 處理分別為 0.01、0.10、0.50、1.00、5.00g/mL 的烯唑醇系列濃度處理，同時(shí)以不含藥劑的無菌PDA平板菌餅為對(duì)照處理，將打取的菌餅分別接入含藥培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基的中央，每處理重復(fù)5次，每皿接1 個(gè)菌餅，置于20 ℃光照培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。按以下公式計(jì)算菌絲在不同濃度藥劑處理下的菌絲生長抑制率（R）。

1.2.2 敏感性分布圖繪制及敏感基線的確定 根據(jù)“1.2.1”中的敏感性測(cè)定結(jié)果，將其從低到高依次分為幾個(gè)不同區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間菌株EC50 值頻數(shù)，計(jì)算出其占整個(gè)群體的頻率（%），以菌株EC50 值為x 軸、相應(yīng)敏感性頻率為y 軸，繪制三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性頻率分布圖。根據(jù)建立的敏感性頻率分布圖確定敏感基線。

1.2.3 抗性水平測(cè)定 利用所建立的相對(duì)敏感基線，求出三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的抗性指數(shù)和抗性菌株頻率?？剐灾笖?shù)≤3 為敏感菌株（S）；3 ＜抗性指數(shù)≤10為低抗菌株（LR）；10＜抗性指數(shù)≤100為中抗菌株（MR）；抗性指數(shù)＞100 為高抗菌株（HR）[12]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將“1.2.1”敏感性測(cè)定中抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值，利用DPS v7.05 數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算出烯唑醇抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和烯唑醇對(duì)三七黑斑病菌的EC50（g/mL）；利用 SPSS 22.0 軟件對(duì)“1.2.2”中所得敏感性頻率分布進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)；采用SPSS 22.0 軟件對(duì)計(jì)算出的菌株EC50 值進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七黑斑病病菌對(duì)烯唑醇的敏感性及敏感基線的建立

采用菌絲生長速率法測(cè)定所獲50 個(gè)三七黑斑病菌株對(duì)烯唑醇的敏感性，結(jié)果顯示50 個(gè)三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的EC50 值為0.1739～6.6707/mL，平均EC50值為（1.784 5±1.195 4）g/mL，最大值是最小值的38.3倍。根據(jù)所測(cè)50 個(gè)三七黑斑病菌的EC50 值，設(shè)置0.5g/mL 的截距將其分成10 個(gè)區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間的菌株數(shù)和占總?cè)后w頻率，建立三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性頻率分布圖（圖1）。利用SPSS 對(duì)其進(jìn)行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示其敏感性頻率分布不符合正態(tài)性分布（W=0.865，P ＜0.05），表明三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性產(chǎn)生一定分化，出現(xiàn)敏感性降低的亞群體。

供試菌株對(duì)烯唑醇的敏感性已出現(xiàn)一定的分化，但仍有82%的菌株（41 株）敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖2），將這41 株菌株用SPSS進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該群體對(duì)烯唑醇的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布（W=0.951，P=0.076 ＞ 0.05），其EC50 平均值為（1.354 2 ± 0.652 9）g/mL，故可將其平均值初步作為三七黑斑病病菌對(duì)烯唑醇的相對(duì)敏感基線。

2.2 不同地區(qū)三七黑斑病菌菌株對(duì)烯唑醇的敏感性差異

不同地區(qū)來源的三七黑斑病菌株對(duì)烯唑醇的敏感性不同（表1），石林地區(qū)菌株的EC50值為0.173 9～6.670 7g/mL，敏感性差異倍數(shù)最大，達(dá)38.4 倍，平均EC50 最高，為 2.417 4g/mL，表現(xiàn)為最不敏感；其次是丘北地區(qū)，菌株EC50 值為0.256 5～2.734 3g/mL，敏感性差異倍數(shù)約為10.7 倍；西雙版納地區(qū)菌株的EC50值為0.543 4～3.326 3g/mL，敏感性差異倍數(shù)約為6.1倍；硯山地區(qū)菌株的EC50 值為0.6073～3.6299g/mL，敏感性差異倍數(shù)最小，為6.0倍，平均EC50最低，為1.3050g/mL，表現(xiàn)為最敏感。其中，來自石林的菌株HS0（80.1739g/mL）對(duì)烯唑醇的敏感性最高（圖3A），而同樣來自石林的菌株HS04（6.670 7g/mL）對(duì)烯唑醇的敏感性則最低（圖3B），說明相同地區(qū)的菌株敏感性也存在一定差異。僅在石林地區(qū)檢測(cè)出對(duì)烯唑醇表現(xiàn)為低抗的菌株，其余地區(qū)菌株對(duì)烯唑醇均表現(xiàn)為敏感。

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2.3 不同地區(qū)來源菌株對(duì)烯唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

從云南省4 個(gè)地區(qū)每地區(qū)隨機(jī)抽取8 株三七黑斑病菌株，共32 株，對(duì)其EC50值進(jìn)行聚類分析，聚類系譜圖顯示（圖4），烯唑醇32 個(gè)菌株的EC50 值可分為3個(gè)聚類組，每組分別包含20、8、4 個(gè)菌株。第一聚類組中出現(xiàn)菌株數(shù)較多，包含4 個(gè)地區(qū)菌株；第二聚類組包含除硯山以外其余3 個(gè)地區(qū)菌株；第三聚類組中包含除西雙版納以外其余3 個(gè)地區(qū)菌株。表明三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性差異與菌株來源具有一定的相關(guān)性。

圖4 不同地理來源菌株對(duì)烯唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis of susceptibility levels of strains from different geographical sources to diniconazole

2.4 菌株對(duì)烯唑醇的抗性水平

50 個(gè)菌株中有48 個(gè)敏感菌株，占總菌株的96%，為優(yōu)勢(shì)群體；2 個(gè)低抗菌株，占總菌株的4%；無中抗菌株和高抗菌株出現(xiàn)。各菌株對(duì)烯唑醇的抗性指數(shù)在0.13～4.93，平均抗性指數(shù)為1.31。對(duì)烯唑醇的抗藥性以硯山地區(qū)菌株最弱，抗性指數(shù)為0.96，石林地區(qū)菌株對(duì)烯唑醇的抗性指數(shù)最高，為1.78。4 個(gè)地區(qū)的三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的抗藥性表現(xiàn)為硯山＜丘北＜西雙版納＜石林（表2）。

表2 云南省不同地區(qū)三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的抗性Table 2 Resistance for to diniconazole in different regions in Yunnan

3 討論

三七作為云南省最具特色的優(yōu)勢(shì)生物資源之一，種植面積不斷增加，由于其對(duì)生長環(huán)境的特殊要求，較易受到不同病害的影響。三七黑斑病是三七主要病害之一，近年在各三七產(chǎn)區(qū)持續(xù)爆發(fā)，造成三七產(chǎn)量和品質(zhì)的不斷下降。目前，對(duì)三七黑斑病的防治主要以化學(xué)藥劑為主。三唑類殺菌劑能有效抑制子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門及半知菌亞門的病原菌生長，對(duì)番茄葉霉病菌[13]、花生黑腐病菌[14]、枸杞炭疽病菌[15]、煙草赤星病菌[16]等多種真菌性病害防治效果較好。烯唑醇作為使用廣泛的三唑類殺菌劑，具有效果強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長和內(nèi)吸輸導(dǎo)性好等特點(diǎn)，能有效防治白粉病[17]、紋枯病[18]和杧果流膠病[19]等多種真菌性病害的發(fā)生，但其作用位點(diǎn)相對(duì)單一，包媛媛等[7]研究發(fā)現(xiàn)烯唑醇對(duì)抑制病原菌菌絲生長有較好效果，但對(duì)病原菌孢子的生長抑制效果較差。隨著用藥時(shí)間和劑量的不斷增加，以及對(duì)烯唑醇的連續(xù)單獨(dú)使用，已發(fā)現(xiàn)部分植物病害對(duì)烯唑醇敏感性下降，如甘林等[9]在進(jìn)行福建玉米小斑病菌對(duì)殺菌劑的毒力測(cè)定時(shí)就發(fā)現(xiàn)病菌對(duì)烯唑醇敏感性下降；徐建強(qiáng)等[20]研究也發(fā)現(xiàn)在小麥紋枯病中出現(xiàn)對(duì)烯唑醇敏感性下降的亞群體。但一直以來尚無學(xué)者開展三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性的相關(guān)報(bào)道，該試驗(yàn)首次初步進(jìn)行三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在三七黑斑病菌中同樣出現(xiàn)對(duì)烯唑醇敏感性下降的亞群體。

本研究在室內(nèi)初步測(cè)定三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性，大部分菌株對(duì)烯唑醇處于敏感水平，僅菌株HS04 和HS14 對(duì)烯唑醇表現(xiàn)為低抗，說明云南省三七黑斑病菌還沒有對(duì)烯唑醇產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性，但抗性菌株的出現(xiàn)，表明使用烯唑醇對(duì)防治三七黑斑病仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，而最終是否會(huì)影響烯唑醇的田間防治效果，還需要通過田間藥劑防效試驗(yàn)進(jìn)一步明確，后續(xù)應(yīng)持續(xù)關(guān)注三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性水平。為延緩三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的抗性發(fā)展，建議在三七種植中避免對(duì)烯唑醇的重復(fù)施用，嚴(yán)格把控使用量，或?qū)⑵渫渌愃巹┡浜鲜┯?。為有效防治三七黑斑病，在生產(chǎn)上應(yīng)盡量減少烯唑醇類藥劑的單一、重復(fù)使用，嚴(yán)格控制其施用劑量和間隔時(shí)間，可將烯唑醇與不產(chǎn)生交互抗性的藥劑相配合使用，減少其抗性風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究采用菌絲生長速率法，測(cè)定了分離自云南省硯山、石林、西雙版納和丘北等不同三七種植基地的50 個(gè)三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的敏感性。三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的EC50 值為0.173 9～6.670 7g/mL，平均EC50 值為（1.784 5±1.195 4）g/mL，最大值是最小值的38.3 倍，以組成連續(xù)單峰頻次82%以上菌株群體的 EC50 平均值（1.354 2 ± 0.652 9）g/mL 初步建立了三七黑斑病菌對(duì)烯唑醇的相對(duì)敏感基線。50 個(gè)三七黑斑病菌株中，有48 個(gè)敏感菌株，2 個(gè)低抗菌株，表明云南省三七黑斑病菌已有對(duì)烯唑醇產(chǎn)生抗藥性的趨勢(shì)。