反式-2-己烯醛對梨果黑斑病菌Alternaria alternata的抑菌作用及其機理

董玉鵬，孫 萍，李永才*，畢 陽，張 苗，黃 怡，張婷婷

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneideri cv. Zaosu）是中國西北地區(qū)主栽的梨品種，其果大核小、果皮翠綠，質(zhì)細酥脆、汁多味甜，深受消費者青睞[1]。然而早酥梨通常采收于夏季高溫時節(jié)，快速的品質(zhì)劣變及腐敗致使采后果實損失嚴重，制約了早酥梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。其中由互隔交鏈孢（Alternaria alte rnata）引起的黑斑病是早酥梨采后主要的病害之一[3]，A. alternata能在室溫或低溫環(huán)境下快速生長而使果實腐敗變質(zhì)，并在生長過程中產(chǎn)生多種真菌毒素，對人類和動物健康造成潛在安全風(fēng)險[4]。目前主要采用抑霉唑和噻苯達唑[5]等化學(xué)殺菌劑控制梨果采后病害，但長期使用化學(xué)殺菌劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染，并危害人體健康[6]。因此，尋求和開發(fā)更加安全、高效的植物源殺菌劑來防治A. alternata引起的早酥梨黑斑病迫在眉睫[7]。

綠葉揮發(fā)物是植物不飽和脂肪酸經(jīng)過催化而形成的一類含有6 個碳的小分子醛、醇和酯類化合物[8]。其主要參與植物特殊氣味形成，在植物直接和間接防御應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[9]，其中很多揮發(fā)物具有抑菌、殺菌作用。孟雪等[10]發(fā)現(xiàn)，綠蘿和常春藤的3 種主要揮發(fā)物α-蒎烯、莰烯和桉樹腦對枝孢霉（Cladosporium sp.）、鏈格孢（Alternaria sp.）、附球菌（Epicoccum sp.）、青霉（Penicillium sp.）和黑曲霉（Aspergillus niger）具有較強的抑菌作用。梁海燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)(Z)-3-己烯醛、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯-1-醇等7 種綠葉揮發(fā)物均對黃曲霉的菌絲生長有明顯抑 制作用；同時研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇、檸檬烯、(E)-2-己烯醛等12 種揮發(fā)物對哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的生長和產(chǎn)孢量均有抑制作用[12]。其中反式-2-己烯醛（C6H10O）屬于綠葉揮發(fā)物的一種，是大多數(shù)綠色植物受損傷后都能快速合成并釋放的揮發(fā)性物質(zhì)。已有研究表明反式-2-己烯醛能顯著抑制黃曲霉菌（Aspergillus fiavus）[13]和草莓炭疽病菌（Colletotrichum acutatum）[14]的菌絲生長。Menniti等[15]還發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛對玉米粒儲藏期病原菌串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）有顯著的抑制作用。目前有關(guān)反式-2-己烯醛對梨果黑斑病菌（A. alternata）的抑菌作用及其機理鮮見 報道。因此本實驗以梨果黑斑病菌A. alternata為對象，研究植物源揮發(fā)性物質(zhì)反式-2-己烯醛對A. al ternata生長的抑制和對黑斑病的控制作用，并進一步探討其抑菌作用的機理， 以期為反式-2-己烯醛作為天然防腐殺菌劑在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試鏈格孢Alternaria alternat a分離于貯藏中自然發(fā)病的梨果實，純化、鑒定后用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基保存待用。

供試早酥梨采摘于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場，挑選大小一致、無機械損傷、無病蟲害的果實， 紙箱包 裝后運達實驗室，冷庫低溫貯藏待用。

反式-2-己烯醛（純度≥98%） 上海麥克林生化科技有限公司；毒素標準品 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、硫酸鎂和乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣 技術(shù)有限公司；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡、DDS-370型微型電導(dǎo)儀日本奧林巴斯 工業(yè)有限公司；UV2450型紫外分光光度計日本島津公司；H-1850R型臺式 高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；A WL-1002-M超純水儀 美國艾科浦國際有限公司；U-LH100-3 型熒光顯微鏡 上海永科光學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 A. alternata孢子懸浮液的配制

參照高春麗等[16]的方法并略作修改，向在無菌操作條件下向培養(yǎng)5 d的A. alternata培養(yǎng)皿中倒入少量無菌水，并加入少量質(zhì)量分數(shù)0.01% Tween-80，用滅菌的涂布器輕刮，將所得溶液通過4 層紗布過濾到滅菌三角瓶中，用無菌水稀釋，在混合器上振蕩15 s，用血球計數(shù)板計數(shù)，配制成1×106個/mL孢子懸浮液。1.3.2 A. alternata生長及致病性分析1.3.2.1 A. alternata孢子萌發(fā)率的測定

采用紙片擴散法測定A. alternata孢子萌發(fā)率，無菌條件下，用打孔器制取直徑為9 mm的質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂培養(yǎng)基，置于滅過菌的載玻片上，滴加上述孢子懸浮液20 μL，再用無菌鑷子取一濾紙片（直徑15 mm）置于皿蓋中央，在濾紙片上加入0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的反式-2-己烯醛溶液各20 μL，以無菌水作對照，于27 ℃孵育，6 h后鏡檢觀察孢子萌發(fā)情況。每次鏡檢100 個真菌孢子，每次實驗重復(fù)3 次。孢子萌發(fā)率計算如下式所示。

1.3.2.2 A. alte rnata菌絲生長情況分析

采用濾紙片擴散法測定菌落直徑，使用直徑為90 mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，每皿加入PDA培養(yǎng)基20 mL，待培養(yǎng)基凝固后，分別接種27 ℃下培養(yǎng)7 d的直徑為8 mm的菌餅，再用無菌鑷子取一濾紙片（直徑15 mm）置于皿蓋中央，在濾紙片上加入0.5、1、1.5 μL/mL和2 μL/mL的反式-2-己烯醛溶液各20 μL，以無菌水作對照，然后27 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.2.3 早酥梨果實黑斑病病斑直徑的測定

參照Moscoso-Ramírez[17]和張智毅[18]等的方法略作修改，選擇貯藏于5～10 ℃下的外觀整齊、無病蟲害的早酥梨，先用自來水沖洗后，再用體積分數(shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min進行表面消毒，然后再用無菌水沖洗后在實驗臺上自然晾干，隨后再用體積分數(shù)75%乙醇溶液進行表面消毒，最后用高壓滅菌的打孔器（直徑3 mm）在果實赤道部位均勻打出3 mm×3 mm的傷口3 個，1 h后用移液槍接種25 μL孢子懸浮液，室溫下晾干，2 h后放于塑料托盤中，快速放入盛有0.5、1、1.5 μL/mL和2 μL/mL反式-2-己烯醛溶液燒杯的塑料密封盒（38 cm×25 cm×14 cm）內(nèi)，立即密封，熏蒸12 h。無菌水作對照，熏蒸結(jié)束后用市售聚乙烯保鮮袋（40 cm×25 cm，厚度0.02 mm）包裝，在室溫（（26±2）℃）下進行貯藏，每隔1 d觀察并測定病斑 直徑。每個處理用果實10 個，重復(fù)3 次。

1.3.3A. alternata細胞膜完整性分析

1.3.3.1A. alternata細胞膜完整率測定

向1.3.1節(jié)中得到的孢子懸浮液（1×106個/mL）中分別加入等量的劑量為1、2 μL/mL的反式-2-己烯醛溶液，以無菌水作為對照，混合均勻，（26±2）℃避光靜置30 min后，用0.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）沖洗后，離心后所得孢子沉淀再重懸于含有20 ng/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）的PBS（pH 7.0）中，在U-LH100-3型熒光顯微鏡下（激發(fā)波長為620 nm）觀察拍照。每次實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.2A. alternata細胞膜電導(dǎo)率測定

采用微型電導(dǎo)儀測定反式-2-己烯醛對A. alternata電導(dǎo)率的影響。將A. alternata接種于PDA培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)4 d后，取菌絲體3 g在PBS（pH 7.0）中混和均勻。加入劑量為1、2 μL/mL反式-2-己烯醛溶液中分別處理 0、30、60、120、150、180 min后，測定其細胞膜電導(dǎo)率，用PBS（pH 7.0）作對照。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.3.3A. alternata核酸滲漏量測定

參照Paul等[19]的方法略作修改，A. alternata培養(yǎng)及處理方法同1.3.3.2節(jié)，加入劑量為1、2 μL/mL反式-2-己烯醛溶液中分別處理1、2、3、4、5 h取樣，12 000 r/min離心2 min收集上清液，在260 nm波長處測定吸光度，對照組用PB S（pH 7.0）進行校正。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.4A. alternata毒素提取與分析

1.3.4.1A. alternata毒素標 準溶液的配制

標準貯備液：用甲醇準確定容1 mg標準品至1 mL，配成1 mg/mL的標準貯備液，密封冷凍儲存于－20 ℃冰箱。

標準工作液：分別配制10、20、50、100、200 μg/mL和1 000 μg/mL的交鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）的標準溶液，5、50、100、200、500 μg/mL和1 000 μg/mL的交鏈格烯（altenuene，ALT）和騰毒素（tentoxin，TEN）的混合標準溶液，密封保存于－20 ℃冰箱。

1.3.4.2 真菌毒素 的提取與測定

準確稱取用2 μL/mL反式-2-己烯醛處理后培養(yǎng)4 d的A. alternata菌絲0.50 g（精確至0.01 g），冰浴研磨均勻，置于10 mL無菌離心管中，加入2.5 mL含體積分數(shù)0.3%甲酸的乙腈-水（80∶20，V/V）的提取液，漩渦混勻，150 r/min常溫提取30 min，再加入0.25 g無水MgSO4和0.04 g NaCl，劇烈振蕩1 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，準確定容至1.2 mL，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

色譜條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL；流動相A為去離子水，流動相B為甲醇；梯度洗脫條件為70% A保持1 min后，2 min內(nèi)降至50%后在1 min內(nèi)繼續(xù)降至10%，保持2 min，之后在0.1 min內(nèi)升至90%，保持2 min；流速0.3 mL/min；總運行時間7.1 min。

質(zhì)譜條件：離子源模式：正離子模式，電噴霧離子源（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測；鞘氣溫度：350 ℃；霧化器壓力：35 psi；鞘氣流量：11.0 L/min；毛細管電壓：4 000 V，其他參數(shù)通過儀器調(diào)至最優(yōu)。

4 種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4 種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Optimized tandem mass parameters for 4 mycotoxins

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件計算標準偏差，并用Origin 8.0軟件作圖，用SPSS 20.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan’s多重差異顯著分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反式-2-己烯醛處理對A. alternata生長及致病性的影響

2.1.1 反式-2-己烯醛處理對A. a lte rnata孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

圖1 反式-2-己烯醛處理對A. alternnaattaa孢 子萌發(fā)（6 h）（A）和菌絲生長（5 d）（B）的影響Fig. 1 Effect of trans-2-hexenal treatment on spore germination (6 h) (A)and mycelial growth (5 d) (B) of A. altern ata

從圖1A可知，反式-2-己烯醛處理顯著抑制了A. alternata孢子的萌發(fā)（P＜0.05），且其抑制效果隨處理劑量的增加而增強，當(dāng)處理劑量為2 μL/mL時，孢子的萌發(fā)率 僅為對照的13.90%。同時反式-2-己烯醛熏蒸處理也顯著地抑制了A. alternata菌絲生長（P＜0.05），且其抑制作用 也存在顯著的劑量依賴性，當(dāng)劑量為2 μL/mL時，其 菌落直徑僅為對照組的36.67%（圖1B）。

2.1.2 反式-2-己烯醛處理 對損傷接種早酥梨黑斑病擴展的影響

圖2 反式-2-己烯醛處理對早酥梨黑斑病擴展的影響（（26±2）℃、7 d）Fig. 2 Effect o f trans-2-hexenal treatment on lesion diameter of black spot in pear fruit (after storage at (26 ± 2) ℃ for 7 d)

反式-2-己烯醛熏蒸處理顯著抑制了損傷接種A. alternata早酥梨果實黑斑病的擴展（圖2），且病斑直徑與反式-2-己烯醛的處理劑量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），貯藏7 d時，2 μL/mL反式2-己烯醛處理組果實病斑直徑僅為對照組的50%。

2.2 反式-2-己烯醛處理對A. alternata細胞膜完整性的影響

2.2.1 反式-2-己烯醛處理后PI染色檢測細胞膜完整率

圖3 反式-2-己烯醛處理后PI染色檢測細胞膜完整率（A）和PI染色細胞比例（BB）Fig. 3 Examination of cell membrane integrity after trans-2-hexenal treatment by propidium iodide (PI) staining (A) and PI staining percentage (B)

PI染色結(jié)果表明，對照組A. alternata的熒光強度極其微弱，而反式 -2-己烯醛處理的A. alternata熒光強度隨處理劑量的增加明顯增強（圖3A），表明A. alternata的細胞膜遭到了嚴重的破壞。進一步統(tǒng)計分析表明，對照組的細胞膜完整率為89.33%，1 μL/mL反式-2-己烯醛處理的A. alternata細胞膜完整率較對照下降20%，當(dāng)反式-2-己烯醛劑量達到2 μL/mL時，細 胞膜的完整率僅為52%（圖3B）。

2.2.2 反式-2-己烯醛處理對A. alternata電導(dǎo)率的影響

圖4 反式-2-己烯醛處理對A. alternata細胞膜電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effect of the trans-2-hexenal on treatment on cell membr ane electrical conductivity of A. alternata

A. alternata對照組的菌絲體電導(dǎo)率隨處理時間的延長稍有增大，120 min后基本保持不變，而反式-2-己烯醛處理的A. alternata菌絲體電導(dǎo)率顯著高于對照組（P＜0.05），且隨處理時間延長和處理劑量的增加而逐漸增大（圖4），其中2 μL/mL反式-2-己烯醛處理的A. alternata菌絲體的電導(dǎo)率 在處理后的180 min時高達對照組的2.31 倍。

2.2.3 反式-2-己烯醛處理對A. alternata核酸滲漏的影響

圖5 反式-2-己烯醛處理對A. alternata核酸滲漏的影響Fig. 5 Effect of the trans-2-hexenal treatmen t on leakage of nuclear acid from A. alternata

反式-2-己烯醛處理加速了A. alternata核酸外滲（圖5），且隨著反式-2-己烯醛處理劑量的增加，培養(yǎng)液中核酸含量顯著提高（P＜0.05）。處理后5 h時，2 μL/mL反式-2-己烯醛處理A. alternata后培養(yǎng)液中核酸含量為對照組的2.98 倍。

2.4 反式-2-己烯醛處理對A. alternata毒素產(chǎn)生的影響

圖6 反式-2-己烯醛處理對A. alternaattaa毒素產(chǎn)生的影響（44 dd）Fig. 6 Effect of trans-2-hexenal treatment on mycotoxin production of A. alternata (4 d)

對離體條件下A. alternata生長過程中毒素的產(chǎn)生進行分析比較。結(jié)果表明，A. alternata生長過程中，菌絲體中會有大量的AME、AOH、ALT和TEN生成，而反式-2-己烯醛處理顯著抑制了A. alternata菌絲體中AME、AOH、ALT和TEN 4 種主要毒素的產(chǎn)生（圖6），雖然反式-2-己烯醛處理對不同毒素產(chǎn)生的抑制作用存在差異，但反式-2-己烯醛處理后，A. alternata菌絲體中4 種毒素產(chǎn)生量均顯著低于對 照（P＜0.05）。其中，2 μL/mL反式-2-己烯醛處理后A. alternata中AME、AOH、ALT和TEN毒素含量分別為對照的51.09%、86.16%、16.67%和38.85%。

3 討 論

已有研究表明，作為綠葉揮發(fā)物的反式-2-己烯醛具有顯著的抑菌活性和防腐作用。本研究結(jié)果表明：2 μL/mL反式-2-己烯醛熏蒸處理能顯著抑制A. alternata孢子萌發(fā)和菌絲生長（圖1），且能夠有效控制梨果黑斑病的擴展（圖2）。這一結(jié)果與趙璐玲等[20]在玉米黃曲霉控制中的研究相似，其發(fā)現(xiàn)0.05 μL/mL反式-2-己烯醛熏蒸12 h能完全抑制儲藏玉米中黃曲霉的生長，而當(dāng)劑量達到0.1 μL/mL時，反式-2-己烯醛對獼猴桃貯藏過程中擴展青霉（Penicillium expansum）菌絲生長具有顯著的抑制作用[21]。另外Archbold等[22]研究發(fā)現(xiàn)用1.71 mmol/L的反式-2-己烯醛熏蒸處理可以降低無籽葡萄貯藏期間霉菌的發(fā)生率?？梢姺词?2-己烯醛具有廣譜的抗菌活性，但不同病原菌及寄主對反式-2-己烯醛的敏感性存在差異。

完整的細胞膜是菌體正常生長代謝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[23]，大多數(shù)抑菌活性物質(zhì)通過影響細胞膜完整性而發(fā)揮作用。已有 研究發(fā)現(xiàn)1.08 mg/mL的檸 檬 醛使阪崎腸桿菌細胞 膜完整率較對照降低15%[24]；0.25 mg/mL的茴香精油能夠破壞志賀氏菌細胞膜完整性[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)2 μL/mL的反式-2-己烯醛處理嚴重地破壞了A. alternata細胞膜完整性（圖3）。病原物細胞膜被破壞后，細胞膜流動性喪失，細胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏[26]，致使 溶液中的電導(dǎo)率升高，并伴隨一些重要細胞內(nèi)含物如蛋白質(zhì)、核酸和糖類物質(zhì)流出，嚴重影響菌體的正常生長。本實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛處理顯著提高了A. a lternata膜電導(dǎo)率（圖4）和核酸滲出率（圖5）。同樣地，陶能國等[27]發(fā)現(xiàn)檸檬醛+辛醛混合物能破壞指狀青霉的細胞膜完整性，增大細胞膜電導(dǎo)率，導(dǎo)致核酸等細胞內(nèi)含物泄漏。Li Wusun等[28]研究還發(fā)現(xiàn)242.5 mg/L的對香豆酸甲酯處理能夠引起A. alternata細胞間電解質(zhì)、可溶性蛋白、糖和核苷酸大量滲漏。有研究認為反式-2-己烯醛之所以有較強的抑菌活性 ，可能因為其結(jié)構(gòu)中的α-、β-不飽和羰基能與病原菌細胞膜上的親電基團（如巰基或氨基）發(fā)生加合反應(yīng)，形成加合物，而使病原菌“失活”[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛是通過抑制己糖或氨基己糖等真菌細胞壁特有成分的生物合成路徑而破壞細胞壁達到抑菌作用[30]。關(guān)于反式-2-己烯醛的作用靶點及具體抑菌機理，尚需進一步研究。

A. alternata作為果蔬采后主要致腐病原物，其不僅能導(dǎo)致果蔬腐爛，而且侵染過程中還會產(chǎn)生多種鏈格孢毒素，部分毒素污染后會造成人和 動物急性或慢性中毒，甚至具有致畸、致癌、致突變作用；因此，抑制真菌毒素產(chǎn)生或加速其降解對保障果蔬安全具有十分重要的意義[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)綠葉揮發(fā)物質(zhì)反式-2-己烯醛處理，能有效地抑制A. alternata 4 種真菌毒素的合成，且抑制作用因毒素種類而不同（圖6）。Yun等[33]報道肉桂醛可以使肉湯培養(yǎng)中黃曲霉毒素的產(chǎn)量降低60%，同樣有大量研究表明精油中的揮發(fā)性化 合物能抑制真菌毒素的合成[34-35]。但Xu Lingchun等[36]還發(fā)現(xiàn)0.2 μL/mL的肉桂醛處理對A. alternata AOH和AME毒素具有體內(nèi)降解作用。但有關(guān)反式-2-己烯醛對A. alternata 毒素合成的調(diào)控機理仍需進一步研究闡明。

4 結(jié) 論

綠葉揮發(fā)物質(zhì)反式-2-己烯醛能夠顯著抑制A. alternata孢子萌發(fā)和菌絲生長，并有效控制梨果黑斑病的擴展，且其作用效果存在劑量依賴性。反式-2-己烯醛處理嚴重地破壞了A. alte rnata細胞膜完整性，增加了細胞膜透性，導(dǎo)致核酸外滲。反式-2-己烯醛處理能顯著抑制A. alternate AME、AOH、ALT和TEN 4 種毒素的合成。