凍干驢乳粉全成分分析

貼航，廖峰，薛圣然，張建嶺，蘇寧

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.中檢科（北京）化妝品技術(shù)有限公司，北京 100176；3.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東東阿，252201)

0 引 言

目前，驢乳以其營養(yǎng)價值和健康效益逐漸引起了人們的關(guān)注。與其他原料乳相比，驢乳最重要的特征是其營養(yǎng)成分與母乳類似，且有許多獨特的優(yōu)勢[1]。因此，在牛乳蛋白過敏的情況下，與其他反芻動物乳相比，驢乳是良好的嬰兒營養(yǎng)的替代品[1]。唐代孫思邈《千金要方》和明代李時珍《本草綱目》記載了驢乳的藥用價值，驢乳可治療糖尿病和“瘡”[2]。Hip?pocrates 和Pliny 也記載說明，驢乳可治療肝臟、傳染病、發(fā)燒和哮喘等疾病[3]。在古代，歐洲貴族也有利用驢乳洗澡和敷面以保持容顏和皮膚彈性的記載[4]?，F(xiàn)在藥理研究也表明，驢乳具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等活性[5]。但是驢乳發(fā)揮功效的分子基礎(chǔ)卻不是很明確。

目前對驢乳的研究主要集中在低致敏性臨床研究、泌乳期特征、化學(xué)成分分析、功能性研究等方面，但是缺乏對我國特有品種——德州驢驢乳全成分的系統(tǒng)研究。本文采用超高效液相串聯(lián)兩種不同質(zhì)量分析器的高分辨質(zhì)譜技術(shù)對驢乳粉中的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行定性定量的分析。不僅提高了對驢乳的認(rèn)識，也為驢乳的深層次開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

驢乳粉由東阿阿膠股份有限公司提供。

ACQUITY UPLC HSS T3 柱（Waters）；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，購自J&K；2-氯苯丙氨酸（GL Biochem(Shanghai)Ltd.）。

1.2 儀器

LC-MS（Thermo，Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）。

2 方 法

2.1 樣品預(yù)處理

稱取約50 mg 樣品，加入到800 μL 甲醇溶液中，并加入10 μL內(nèi)標(biāo)（3.0 mg/mL，2-氯苯丙氨酸）。將其置于組織研磨儀中65 Hz研磨120 s。水浴超聲30 min而后置于4 ℃離心機(jī)中，12 000 rpm 離心15 min，吸取200 μL上清，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中，待LC-MS檢測分析。

2.2 色譜條件

方法參考文獻(xiàn)[6]，略有改動。Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫為40 ℃，流速恒定0.3 mL/min。流動相組成：A 相，水+0.1%甲酸；B 相，乙腈+0.1%甲酸。進(jìn)樣量4 μL，自動進(jìn)樣器溫度4 ℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件

正模式：加熱器溫度300°C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0KV；毛細(xì)管溫度：350°C；S-Lens RF Level,30%。

負(fù)模式：加熱器溫度300°C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細(xì)管溫度：350°C；S-Lens RF Level,60%。

掃描模式：一級全掃描(Full Scan，m/z 50～1000)與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描(dd-MS2，TopN=10)；分辨率：60,000(一級質(zhì)譜)&17,500(二級質(zhì)譜)。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

3 結(jié)果與分析

應(yīng)用多質(zhì)量分析器組合式質(zhì)譜儀對驢乳粉進(jìn)行MSn級掃描，最終獲得驢乳粉主要代謝產(chǎn)物信息，形成樣本的營養(yǎng)成分譜庫。圖1 為驢乳粉的總離子流圖。根據(jù)Compound Discoverer 軟件處理得到Mass 數(shù)據(jù)，基于Metlin 進(jìn)行全譜鑒定。共鑒定出87 種代謝物，詳細(xì)信息見表2。代謝物可以分為氨基酸及其衍生物、糖、有機(jī)酸、脂質(zhì)等。

圖1 驢乳粉的總離子圖

3.1 氨基酸及其衍生物

從表2 可知，從驢乳粉中鑒定出16 種氨基酸及其衍生物，其中有6 種必需氨基酸。郭慧媛[7]和李宇[8]等報道，驢乳含有除色氨酸外的8 種必需氨基酸。但是，本試驗卻發(fā)現(xiàn)驢乳含有色氨酸，這與張巖春[9]等人的報道一致。值得注意的是，驢乳富含γ-氨基丁酸、?；撬帷⒔构劝彼?、酪氨酸等活性氨基酸。γ-氨基丁酸是哺乳動物體內(nèi)一種神經(jīng)抑質(zhì)，可減緩機(jī)體氧化應(yīng)激。γ-氨基丁酸可通過激活GSK-3β/Nrf-2 通路保護(hù)胰腺組織、減少胰島β細(xì)胞損傷和影響mTOR/S6K1/IRS-1 途徑提高肌肉對胰島素的敏感性，進(jìn)而緩解2 型糖尿病患者的胰腺損傷和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[10]。?；撬崾菞l件性必需氨基酸，補(bǔ)充適量?；撬崮軌蚪档吞悄虿游镅撬?，改善糖尿病癥狀，且牛磺酸無任何毒副作用[11]。焦谷氨酸不僅具有胰島素樣作用，促進(jìn)葡萄糖合成脂肪[12]；而且是皮膚的天然保濕因子，也對酪氨酸氧化酶等酶類的活性有一定抑制作用，阻止“類黑素”物質(zhì)在皮膚中積沉，使皮膚亮白[12-13]。這些物質(zhì)從分子角度揭示了驢乳防治糖尿病和具有美容養(yǎng)顏功效的分子機(jī)制，也為驢乳防治糖尿病機(jī)制提供新的思路。

表2 驢乳粉LC-MS全譜鑒定

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

3.2 糖類

因驢乳是目前發(fā)現(xiàn)的最接近母乳的天然替代物，因此國內(nèi)外學(xué)者對驢乳中的乳糖及低聚木糖含量研究較多，但是對驢乳中其他糖類的表征研究較少[14]。Murgia 等[14]利用GC-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)驢乳中含有果糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、帕拉金糖等糖類。本文利用ESI-多重質(zhì)譜技術(shù)鑒定出驢乳含有6 種糖類，分別是木糖酸、己糖、糖醇、葡萄糖酸、海藻糖和N-乙酰-α-氨基葡萄糖-1-磷酸酯，首次在驢乳中鑒別出海藻糖。但是，海藻糖廣泛存在于細(xì)菌、真菌、酵母、植物和低等動物中，哺乳動物不具備海藻糖合成能力[15]，因此需進(jìn)一步驗證驢乳中是否存在海藻糖。

3.3 有機(jī)酸類

乳制品存在有機(jī)酸是正常產(chǎn)奶動物的生化代謝過程，比如檸檬酸、馬尿酸、尿酸、乳清酸等。但是目前國內(nèi)外學(xué)者對驢乳有機(jī)酸的研究較少。Murgia等[14]利用GC/MS 發(fā)現(xiàn)驢乳中含有乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等11 種有機(jī)酸。本文利用LC/MS 技術(shù)檢測到驢乳含有乳酸、蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、尿酸、馬尿酸等11 種有機(jī)酸。其中，尿酸、馬尿酸是首次在驢乳中發(fā)現(xiàn)的有機(jī)酸。尿酸作為乳中的抗氧化劑，可能對新生仔驢腸道黏膜具有局部保護(hù)作用[16]。檸檬酸能顯著抑制仔豬腸道乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，但是低劑量的乳酸能顯著促進(jìn)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，檸檬酸、蘋果酸、乳酸等均能有效抑制病原菌的增殖[17]。因此，乳中有機(jī)酸對調(diào)節(jié)飲用乳制品人群的腸道菌群平衡有著重要的意義。

3.4 脂質(zhì)類

Martini[18]、Antonella[19]和豆智華[20]等學(xué)者對驢乳脂肪酸譜進(jìn)行了廣泛的研究。相比于牛乳，驢乳中的脂類更接近母乳中脂類成分：必需脂肪酸的含量高，低飽和脂肪酸的含量低。通過LC/MS 檢測到驢乳粉共有46 種脂類物質(zhì)，其中大多數(shù)的脂類是不飽和脂肪酸，且不飽和脂肪酸含量很高。驢乳粉中癸酸和月桂酸的含量較高，而棕櫚酸和硬脂酸的含量較低，這與Barlowska 等[21]的報道一致。利用LC/MS 首次在驢乳粉中檢出杜鵑花酸，杜鵑花酸對表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、皮屑芽孢菌等細(xì)菌有很好的抗菌效果[23]。杜鵑花酸也對治療色素沉著和痤瘡有很好的效果[22]，這從分子角度解釋了驢乳在美容和治療“瘡”方面的功效。

3.5 其他

利用多重質(zhì)譜在驢乳粉中還鑒定出黃嘌呤、丙二醛、磷酸、尿囊素、香葉酸、肌肽、雄甾烯醇7 種成分。尿囊素是尿酸的衍生物，用途十分廣泛。在醫(yī)藥方面，尿囊素具有促進(jìn)細(xì)胞生長、加快傷口愈合、軟化角質(zhì)蛋白等生理功能，是皮膚創(chuàng)傷的良好愈合劑和抗?jié)兯巹?，對糖尿病、痤瘡均有較好的療效；在化妝品方面，尿囊素具有殺菌、抗氧化作用，能使皮膚保持水分，廣泛用于雀斑霜、粉刺液等產(chǎn)品[23]。肌肽可通過抗氧化、抑制端粒縮短和線粒體損傷、抗糖基化等作用抑制衰老[24]。肌肽也作為主要的抗氧化成分廣泛應(yīng)用于化妝品中。也有研究表明[25]，肌肽可能通過降低左心室氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)改善1 型糖尿病大鼠心功能障礙。這些成分的存在，從分子水平解釋了驢乳“防消渴”等功效。

4 結(jié) 論

利用HPLC 串聯(lián)多重質(zhì)譜的手段鑒定出驢乳粉中的87 種代謝物，主要有氨基酸及其衍生物類、糖類、有機(jī)酸類、脂質(zhì)類和其他5 大類。驢乳粉不僅含有6種必需氨基酸，而且含有γ-氨基丁酸、?；撬帷⒔构劝彼岬然钚园被?，從分子基礎(chǔ)上揭示了驢乳防治糖尿病和美容養(yǎng)顏的潛在功效。首次在驢乳粉中鑒定出海藻糖、尿酸和馬尿酸等成分。但還需進(jìn)一步確認(rèn)驢乳粉中海藻糖的存在。驢乳富含多不飽和脂肪酸，這為驢乳發(fā)揮降血脂等功效提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。杜鵑花酸的存在為驢乳美白、治療痤瘡等功效的分子機(jī)制研究提供了思路。驢乳也富含尿囊素和肌肽等生物活性成分，進(jìn)一步從分子水平解釋了驢乳在美容養(yǎng)顏和防治糖尿病的機(jī)制。本研究對驢乳粉進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化學(xué)成分和生物活性成分研究，為闡明驢乳粉的化學(xué)組成及擴(kuò)大其效用范圍提供了科學(xué)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。