牛奶中3種致病菌多重PCR的建立及初步應(yīng)用

張亞楠，焦仁剛，趙貴，陳錫龍，黃鑫，欒慶祥，章厲劼，彭珊，徐景峨，蒲齡，余波

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽(yáng)550005；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng)550003）

0 引 言

食源性致病菌是引起人類健康和食品安全的主要因素之一，而微生物污染是導(dǎo)致牛奶質(zhì)量問(wèn)題的重要因素，因此牛奶中的致病菌成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。而我國(guó)對(duì)原料奶的質(zhì)量要求遠(yuǎn)低于乳業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家。我國(guó)乳品新國(guó)標(biāo)中僅規(guī)定了生奶中細(xì)菌的最低檢出總數(shù)（少于2×106個(gè)/mL），未對(duì)牛奶中具體的細(xì)菌種類進(jìn)行規(guī)定，這忽視了對(duì)病原菌的檢測(cè)[1]。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌則是牛奶源主要的致病菌，這些食源性致病菌嚴(yán)重影響著人和動(dòng)物的健康[2-4]。因此，需要快捷、靈敏的方法對(duì)牛奶中食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)。

多重PCR（multiplex PCR，mPCR）方法可同時(shí)檢測(cè)多種病原體，且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短和檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，適合大量臨床樣本（特別是混合感染樣本）中病原體的快速檢測(cè)[5]。本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌femB 基因序列、大腸桿菌phoA 基因序列和沙門氏菌invA 基因序列，分別設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物，建立一種能夠同時(shí)快速檢測(cè)牛奶中3 種食源性致病菌的多重PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌ATCC?25922標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌ATCC?13076 標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌ATCC?6538 標(biāo)準(zhǔn)株、牛結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛支原體，均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室保存。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC?7644、志賀氏菌ATCC?8700 購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、500bp DNA Lad?der(Dye Plus)、Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)等購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；LB 液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等均購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 中的金黃色葡萄球菌femB 基因序列（檢索號(hào)：GQ284649.1）、大腸桿菌phoA 基因序列（檢索號(hào)：NC_011750.1）和沙門氏菌invA 基因序列（檢索號(hào)：M90846.1），經(jīng)比對(duì)分析后，采用Primer Premier 5.0 分別設(shè)計(jì)各基因的特異性引物，引物的序列與目的片段大小見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.4 細(xì)菌DNA 的提取

將-80 ℃保存的菌株分別接種于相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)蘇，劃線于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，200 rpm 搖床中培養(yǎng)12 h。參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取細(xì)菌DNA，將提取的DNA 模板于-20 ℃保存。

1.5 單一PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定

單一PCR 反應(yīng)采用25 μL 反應(yīng)體系：Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 加至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行Blast分析，以確認(rèn)目的基因。

1.6 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)多重PCR 反應(yīng)條件，包括退火溫度（50～60 ℃）和引物濃度（5～20 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，同時(shí)以雙蒸水作為空白對(duì)照。多重PCR 反應(yīng)在50 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行：Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)25 μL，3 種細(xì)菌DNA 混合模板2 μL，3 對(duì)上、下游引物各1 μL，ddH2O 加至50μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，50～60 ℃35 s，72 ℃45 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將1.5 測(cè)序比對(duì)無(wú)誤的DNA 片段連到PUC57 載體（2 710 bp）上，構(gòu)建同時(shí)攜帶三個(gè)基因的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌DH5α 中，在加入IPTG、X-Gal的LB 培養(yǎng)基上挑選白色菌落，經(jīng)PCR 鑒定篩選出陽(yáng)性菌株保存。提取陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒，用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定濃度后，經(jīng)10 倍梯度稀釋后作為單一PCR 反應(yīng)和多重PCR 反應(yīng)的模板，用優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的敏感性。

1.8 特異性試驗(yàn)

以混合核酸（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牛結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌的核酸為模板分別進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)，以鑒定該方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的多重PCR 方法，多次重復(fù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及3 種細(xì)菌的混合陽(yáng)性樣本，以驗(yàn)證多重PCR 的穩(wěn)定性。

1.10 多重PCR 對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

將臨床采集的未經(jīng)巴氏殺菌的25 份鮮牛奶樣品（生乳），參照GB19301-2010 測(cè)定生乳中微生物菌落總數(shù)。同時(shí)，將樣品簡(jiǎn)單增菌（樣品∶增菌液=1∶25）后采用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行多重PCR 和單一PCR 擴(kuò)增。

參照GB27342-2009 將25 份鮮牛奶樣品經(jīng)63～65 ℃、30 min 殺菌處理得到巴氏殺菌乳，參照國(guó)標(biāo)GB4789.3平板計(jì)數(shù)法、GB4789.10定性檢驗(yàn)、GB4789.4分別對(duì)大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，經(jīng)簡(jiǎn)單增菌后提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行多重PCR 和單一PCR 檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物的鑒定

單一PCR 結(jié)果表明，擴(kuò)增片段分別為各細(xì)菌的特異性條帶。測(cè)序結(jié)果證實(shí)金黃色葡萄球菌femB 的大小為233 bp，大腸桿菌的phoA 的大小為444 bp，沙門氏菌invA 的大小為724 bp，均與預(yù)期大小相符。經(jīng)比對(duì)分析，結(jié)果顯示各細(xì)菌基因測(cè)序結(jié)果與NCBI 上公布序列同源性達(dá)100%（見(jiàn)圖1）。

2.2 多重PCR 反應(yīng)方法的建立及條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)退火溫度和引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定多重PCR 反應(yīng)在50 μL 反應(yīng)體系中的最佳反應(yīng)條件為，退火溫度52 ℃，引物濃度10 μmol/L，最佳反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，52 ℃35 s，72 ℃45 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。各細(xì)菌的特異性引物均有效擴(kuò)增出了其目的片段，分別為724 bp(沙門氏菌)，444 bp(大腸桿菌)、233 bp(金黃色葡萄球菌)，引物間無(wú)非特異性片段產(chǎn)生（見(jiàn)圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn)

圖1 各基因同源性對(duì)比

圖2 沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄菌多重PCR

經(jīng)PCR 鑒定，本研究成功構(gòu)建同時(shí)攜帶三個(gè)基因的陽(yáng)性質(zhì)粒，大小為4 111 bp（見(jiàn)圖3）。在優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件中，該多重PCR 對(duì)細(xì)菌的最低檢測(cè)量分別為沙門氏菌133.3 pg/mL、大腸桿菌13.3 pg/mL、金黃色葡萄球菌13.3 pg/mL（見(jiàn)圖4）。在單一PCR 反應(yīng)中，各細(xì)菌的最低檢測(cè)量分別為沙門氏菌0.013 pg/mL、大腸桿菌1.33 pg/mL、金黃色葡萄球菌13.3 pg/mL（見(jiàn)圖5、6、7）。

2.4 特異性試驗(yàn)

在特異性試驗(yàn)中，對(duì)混合DNA（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）、沙門氏菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA均擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的片段，而對(duì)其他菌株的DNA未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明該多重PCR具有較好的特異性（見(jiàn)圖8及圖4中11～14孔）。

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒的多重PCR鑒定

圖4 多重PCR敏感性與特異性試驗(yàn)

圖5 沙門氏菌單一PCR敏感性試驗(yàn)

圖6 大腸桿菌單一PCR敏感性試驗(yàn)

圖7 金黃色葡萄球菌單一PCR敏感性試驗(yàn)

圖8 多重PCR特異性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的多重PCR 方法，多次重復(fù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及3 種細(xì)菌的混合陽(yáng)性樣本，均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，表明該多重PCR方法具有較好的重復(fù)性（見(jiàn)圖9）。

2.6 臨床應(yīng)用

25 份未經(jīng)巴氏殺菌的鮮牛奶樣品（即生乳）中微生物菌落總數(shù)均小于2×106，符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生乳中微生物限量的規(guī)定；而多重PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)表2），19 份大腸桿菌陽(yáng)性，2 份沙門氏菌+大腸桿菌雙陽(yáng)性，1 份大腸桿菌+金黃色葡萄球菌雙陽(yáng)性，這與單一PCR 檢測(cè)結(jié)果一致，且與細(xì)菌分離鑒定結(jié)果一致。多重PCR 和單一PCR 對(duì)25 份巴氏殺菌乳經(jīng)簡(jiǎn)單增菌后提取的細(xì)菌DNA 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果無(wú)陽(yáng)性檢出。同時(shí)依照巴氏殺菌乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果均為陰性。

3 討 論

近些年，食品安全問(wèn)題頻發(fā)，而細(xì)菌性食物中毒則是其重要問(wèn)題之一。目前，國(guó)內(nèi)主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法檢測(cè)食品中的病原菌，其操作繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，且混合感染嚴(yán)重導(dǎo)致其方法的靈敏度較低[6]。因此，建立一種快速、有效、靈敏的檢測(cè)方法是很有必要的。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌是引起牛奶微生物污染的主要致病菌。本研究建立的多重PCR 反應(yīng)方法可以對(duì)臨床牛奶樣本中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌單獨(dú)或混合感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)及鑒定。結(jié)果表明，該診斷方法檢測(cè)時(shí)間短、敏感性好、特異性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

多重PCR 反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物和多個(gè)模板，相互之間發(fā)生作用的機(jī)率很大，很容易導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)[7]。因此，多重PCR 的引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，應(yīng)該選擇各自相對(duì)保守的基因序列作為靶基因。本研究中所用引物參考GenBank 中金黃色葡萄菌femB 基因序列高度保守，是金黃色葡萄菌區(qū)別于其他葡萄球菌的一個(gè)特異性染色體標(biāo)志基因[8-9]，同時(shí)femB 基因與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成有關(guān)，它也是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的輔助基因[10-11]。而大腸桿菌堿性磷酸酶phoA基因，是普遍存在于所有的大腸桿菌中的持家基因，具有良好的特異性，它編碼的酶能催化非特異性磷酸單酯水解，對(duì)機(jī)體內(nèi)磷代謝的調(diào)節(jié)有重要作用，還可以作為信號(hào)酶被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)疾病檢測(cè)、免疫學(xué)和分析生物技術(shù)[12-14]。沙門氏菌invA 基因是沙門氏菌的一種侵襲蛋白基因，其編碼的蛋白決定沙門氏菌對(duì)腸粘膜細(xì)胞的侵襲力，是致病性沙門氏菌存在的最直接標(biāo)志[15-16]。本研究根據(jù)以上3 種保守基因序列，擴(kuò)增片段分別為233 bp、444 bp、724 bp，片段大小級(jí)差在200 bp 以上，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后易于分開(kāi)，有很高的辨識(shí)度，在實(shí)際應(yīng)用中不易造成誤判。

影響多重PCR 成功的因素有很多，其中退火溫度會(huì)直接影響引物與模板DNA 的結(jié)合效率，還會(huì)導(dǎo)致PCR 反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增[17]。研究表明，多重PCR 反應(yīng)體系的退火溫度要比單一PCR 擴(kuò)增時(shí)的退火溫度低4 ℃左右[18]。同時(shí)，所有引物對(duì)的最適退火溫度要盡可能的相同，這有助于在多重PCR 反應(yīng)中每對(duì)引物都有相同的擴(kuò)增效率[19]。本研究中的三對(duì)引物在單一PCR 反應(yīng)中退火溫度為55 ℃時(shí)，均能保證很高的擴(kuò)增效率；通過(guò)條件優(yōu)化，多重PCR 反應(yīng)在退火溫度為52 ℃時(shí)效果最優(yōu)。

表2 臨床應(yīng)用

同時(shí)，本研究構(gòu)建了同時(shí)攜帶femB、phoA、invA 三個(gè)基因的質(zhì)粒，作為陽(yáng)性菌株模板。這種方法可獲得大量穩(wěn)定的陽(yáng)性模板DNA，且保證三個(gè)基因的拷貝數(shù)準(zhǔn)確一致，有利于開(kāi)展檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)，也為后續(xù)臨床樣品的檢測(cè)提供穩(wěn)定、準(zhǔn)確的陽(yáng)性對(duì)照。

本研究還表明，巴氏殺菌法能有效地將牛奶中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌這3 種致病菌殺死，但致病菌產(chǎn)生的毒素蛋白的活性是否已經(jīng)全部失活還有待我們進(jìn)一步地探究。同時(shí)，生乳中存在的耐藥菌株產(chǎn)生的滅活酶，如β-內(nèi)酰胺酶等蛋白的活性及安全性風(fēng)險(xiǎn)也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究建立的多重PCR 反應(yīng)方法可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)臨床牛奶樣本中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌單獨(dú)或混合感染進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)構(gòu)建攜帶femB、phoA、invA 三個(gè)基因的陽(yáng)性質(zhì)粒，為臨床檢測(cè)提供穩(wěn)定、準(zhǔn)確的陽(yáng)性對(duì)照，具有廣闊的應(yīng)用前景。