長期施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落的影響*

劉 佳，陳曉芬，劉 明，吳 萌，王伯仁，蔡澤江，張?zhí)伊?，李忠?

長期施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落的影響*

劉 佳1，2，3，陳曉芬1，2，3，劉 明1，吳 萌1，王伯仁4，5，蔡澤江4，5，張?zhí)伊?，2，李忠佩1，2?

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所/國家紅壤改良工程技術(shù)研究中心，南昌 330200；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；5. 祁陽農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，湖南祁陽 426182）

為探討長期不同施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落的影響，以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院祁陽紅壤實(shí)驗(yàn)站的冬小麥—夏玉米定位試驗(yàn)為研究對(duì)象，選取不施肥（CK）、單施氮肥（N）、施化學(xué)氮磷鉀肥（NPK）和化學(xué)氮磷鉀+有機(jī)肥配施（NPKM）4個(gè)處理，于試驗(yàn)開展25年（2015年）小麥?zhǔn)斋@后采集各處理0～20 cm的土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌群落進(jìn)行測定，并深入揭示影響旱地紅壤細(xì)菌群落的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明：（1）長期不同施肥顯著改變了旱地紅壤的化學(xué)性質(zhì)，N和NPK處理的土壤pH顯著降低至4.02和4.15，而NPKM處理的土壤pH顯著上升至5.99。NPK和NPKM處理均顯著改善土壤肥力，但后者效果明顯優(yōu)于前者，而N處理對(duì)土壤肥力的提升效果微弱。（2）長期不同施肥改變了旱地紅壤優(yōu)勢菌的相對(duì)豐度，非度量多維度分析（NMDS）和相似性分析（ANOSIM）表明不同處理的土壤細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化。（3）與CK相比，N處理的4種多樣性指數(shù)（物種豐富度、Chao1指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)）顯著降低了21.4%～49.4%，而NPKM處理顯著增加了7.0%～66.9%，NPK處理也會(huì)使系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)顯著降低10.3%和13.0%。（4）逐步回歸分析表明土壤pH是決定優(yōu)勢菌相對(duì)豐度及4種多樣性指數(shù)的首要因素，多元回歸樹分析（MRT）探明土壤pH共解釋了83.1%的細(xì)菌群落變異，不同處理間細(xì)菌群落轉(zhuǎn)變均由土壤pH驅(qū)動(dòng)。（5）STAMP分析發(fā)現(xiàn)，N、NPK和NPKM處理與CK分別有11、14和8個(gè)顯著差異細(xì)菌屬。綜上所述，長期施肥后旱地紅壤細(xì)菌群落主要受土壤pH的影響，而土壤肥力的作用相對(duì)較弱，長期施用化學(xué)氮肥造成的紅壤酸化的負(fù)面效應(yīng)已遠(yuǎn)超肥力改善的正面效應(yīng)。因此，旱地紅壤施肥應(yīng)以防治土壤酸化為前提，長期化肥有機(jī)肥配施是一項(xiàng)適宜的施肥措施。

長期施肥；旱地紅壤；細(xì)菌群落；高通量測序；土壤pH

紅壤是我國南方熱帶、亞熱帶地區(qū)的典型土壤，總面積148萬km2，占全國耕地總面積的36%，其中旱地農(nóng)田約占紅壤區(qū)耕地總面積的40%[1]。由于強(qiáng)烈的風(fēng)化淋溶，紅壤具有酸性強(qiáng)、有機(jī)質(zhì)含量低、養(yǎng)分匱乏等特征[2]；近幾十年來的過度開發(fā)和不合理利用，又進(jìn)一步加劇了紅壤退化。因此，盡管南方紅壤區(qū)光、熱、水等自然條件優(yōu)越，卻難以得到充分發(fā)揮，紅壤旱地作物如小麥[3]、玉米[4]、花生[5]等的平均產(chǎn)量也遠(yuǎn)低于我國北方地區(qū)。改良紅壤性狀、提高紅壤生產(chǎn)力，是實(shí)現(xiàn)我國南方紅壤區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高土壤肥力、增加作物產(chǎn)量的常用措施，合理施肥可促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)的正向發(fā)展，但施肥不當(dāng)會(huì)引起土壤酸化、養(yǎng)分失衡等一系列環(huán)境問題。微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在土壤肥力的形成，有機(jī)質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化與固定，養(yǎng)分的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[6]。土壤微生物對(duì)環(huán)境變化極其敏感，關(guān)注施肥對(duì)土壤微生物群落的影響是近年來的研究熱點(diǎn)。許多研究表明，施肥改變了土壤肥力狀況，養(yǎng)分含量變化如土壤有機(jī)碳[7-8]、總氮[9-10]等直接驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落轉(zhuǎn)變，增加或降低了微生物群落多樣性；但也有研究認(rèn)為，施肥通過改變土壤性質(zhì)間接作用于土壤微生物[11]，Zeng等[12]發(fā)現(xiàn)施氮造成的土壤pH降低是導(dǎo)致細(xì)菌群落變化的主要原因，Sun等[13]發(fā)現(xiàn)砂姜黑土長期施肥后引起土壤細(xì)菌群落轉(zhuǎn)變的pH閾值為5.74，Ma等[14]發(fā)現(xiàn)施肥造成的土壤C:P和N:P變化決定了土壤微生物群落組成。此外，施肥還可能通過影響地上植物作用于地下微生物[12]?？梢?，施肥對(duì)土壤微生物群落的影響存在多種途徑，具體的影響效果及關(guān)鍵因素具有不確定性，這可能與土壤類型、施肥措施和種植制度等有關(guān)，因此需要開展針對(duì)性研究予以探明，這對(duì)于科學(xué)評(píng)估施肥效果、及時(shí)有效調(diào)整施肥策略具有重要意義。

土壤微生物研究長期以來受到技術(shù)方法的嚴(yán)重制約[15]，近些年來高通量測序技術(shù)取得重大突破，使完整精準(zhǔn)破譯土壤微生物的遺傳信息成為可能。因此，本研究采用當(dāng)下迅速發(fā)展的Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院祁陽紅壤實(shí)驗(yàn)站的定位試驗(yàn)為對(duì)象，研究長期施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落的影響，探明驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵因素及其影響閾值，揭示響應(yīng)不同施肥措施的特異微生物種類，以期為我國南方旱地紅壤的合理施肥和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于湖南省祁陽縣中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院祁陽紅壤實(shí)驗(yàn)站（26°45′12″ N，111°52′32″ E）。該區(qū)域?qū)俚湫偷膩啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年均氣溫18.0℃，≥10℃的積溫5 600 ℃，年均降水量1 255 mm，蒸發(fā)量1 470 mm，無霜期約300 d，日照時(shí)數(shù)約1 610 h[16]。長期施肥定位試驗(yàn)開始于1990年，供試土壤為第四季紅黏土母質(zhì)發(fā)育的紅壤，試驗(yàn)開始時(shí)0～20 cm土壤的基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)為：pH 5.70，土壤有機(jī)碳（SOC）6.06 g·kg–1，全氮（TN）1.07 g·kg–1，全磷（TP）0.52 g·kg–1，全鉀（TK）13.7 g·kg–1，堿解氮（AN）79.0 mg·kg–1，有效磷（AP）13.9 mg·kg–1，速效鉀（AK）104 mg·kg–1[17]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

本研究選取長期施肥定位試驗(yàn)中的4個(gè)處理：①不施肥（CK），②單施氮肥（N），③施化學(xué)氮磷鉀肥（NPK），④化學(xué)氮磷鉀+有機(jī)肥配施（NPKM）。肥料年施用量為：N 300 kg·hm–2、P2O5120 kg·hm–2和K2O 120 kg·hm–2。在NPKM處理中，30%的N來源于化肥，70%的N來源于有機(jī)肥，即保證總施氮量不變。氮肥使用尿素（含N 46%），磷肥使用過磷酸鈣（含P2O512%），鉀肥使用氯化鉀（含K2O 60%），有機(jī)肥使用豬糞（每年施用前測定其含N量）。試驗(yàn)的種植制度為冬小麥—夏玉米輪作。玉米季的化肥施用量占總施用量的70%，小麥季占30%，但有機(jī)肥均在小麥季施用，所有肥料在作物種植前一次性基施。試驗(yàn)小區(qū)面積為196 m2，兩次重復(fù)。

在2015年5月小麥?zhǔn)斋@后采集土壤樣品。采樣時(shí)每小區(qū)分作2個(gè)半?yún)^(qū)進(jìn)行，每個(gè)半?yún)^(qū)用土鉆按“S”形采集0～20 cm土樣10份，徹底混勻后作為一個(gè)樣品，即每處理獲得4個(gè)重復(fù)樣品。土樣采集后盡快帶回室內(nèi)，揀除雜質(zhì)后過2 mm篩，而后將每個(gè)樣品分為兩份：一份風(fēng)干用于測定土壤化學(xué)性質(zhì)，一份保存在?80℃的冰箱中用于提取土壤DNA。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測定

土壤化學(xué)性質(zhì)的測定參照魯如坤[18]的方法進(jìn)行。土壤pH采用電位法測定（水︰土=2.5︰1），土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀氧化—容量法測定，全氮（TN）采用凱氏定氮法測定，全磷（TP）采用碳酸鈉熔融法測定，全鉀（TK）采用氫氧化鈉熔融法測定，堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法測定，有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定，速效鉀（AK）采用乙酸銨浸提—火焰光度法測定。

1.4 土壤DNA的提取和16S rRNA基因的高通量測序

稱取0.5 g土壤樣品用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，美國）進(jìn)行DNA提取，具體方法和步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCG G-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4-V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[19]。PCR反應(yīng)體系包括：PremixDNA聚合酶（5 U·μL–1）25 μL，正、反向引物（20 mg·L–1）各0.5 μL，DNA模板（20 mg·L–1）1 μL，雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；（94 ℃45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s）×35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物用JET quick PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Genomed Gmbh，美國）純化，而后使用Illumina MiSeq PE 250高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.5 高通量測序數(shù)據(jù)分析

MiSeq高通量測序結(jié)果用QIIME軟件進(jìn)行分析[20]。首先將具有相同Barcode引物的序列歸為一類樣品。將高通量測序得到的原始序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)堿基重疊數(shù)不得少于20個(gè)，堿基配對(duì)錯(cuò)誤率為0。拼接后去除q值（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）低于25的低質(zhì)量序列，用UCLUST對(duì)保留的高質(zhì)量序列按97%的相似度進(jìn)行聚類，得到細(xì)菌序列的可操作分類單元（OTU，Operational taxonomic units），選擇每個(gè)OTU中數(shù)量最多的序列作為該OTU的代表序列。采用PyNAST方法將所有代表序列對(duì)齊后建立系統(tǒng)發(fā)育樹并計(jì)算系統(tǒng)發(fā)育多樣性。用RDP Classifier將OTU代表序列與Silva的16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)可信度為0.8[21]，生成具有物種豐度信息的OTU表用于后續(xù)分析。高通量測序的原始數(shù)據(jù)保存在ENA（European Nucleotide Archive）數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)為PRJEB30581。

1.6 數(shù)據(jù)處理

土壤化學(xué)性質(zhì)、優(yōu)勢菌（平均相對(duì)豐度＞1%）相對(duì)豐度、細(xì)菌多樣性等指標(biāo)采用單因素方差分析、Duncan多重比較來判斷差異顯著性（<0.05）；采用逐步回歸分析揭示優(yōu)勢菌相對(duì)豐度、細(xì)菌多樣性與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。采用非度量多維度分析（NMDS，Non-metric multidimensional scaling）揭示不同處理細(xì)菌群落組成的差異，并用相似性分析[22]（ANOSIM，Analysis of similarities）判斷差異是否達(dá)到顯著水平（<0.05）。采用多元回歸樹分析[23]（MRT，Multivariate regression tree）研究細(xì)菌群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。采用STAMP分析[24]（Statistical analysis of metagenomic profiles）揭示不同處理之間的顯著差異物種。單因素方差分析、Duncan多重比較、逐步回歸分析使用PASW Statistics 18.0完成，NMDS和ANOSIM分析使用R軟件（Version 3.4.4）的vegan包完成，MRT分析使用R軟件（Version 2.7.2）的mvpart包完成，STAMP分析使用STAMP軟件完成。Origin 8.5作圖。

2 結(jié) 果

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

經(jīng)過25 a長期不同施肥，旱地紅壤的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了顯著變化（表1）。N和NPK處理的土壤pH分別降低至4.02和4.15，而NPKM處理的土壤pH升高至5.99。NPK和NPKM處理均在不同程度上改善了土壤的肥力狀況。與CK相比，NPK處理使土壤SOC、TN、TP和AN均顯著提高（<0.05），分別提高了0.54倍、0.44倍、1.50倍和0.70倍，而NPKM處理對(duì)上述指標(biāo)的提高幅度更大，分別達(dá)到1.11倍、1.18倍、3.65倍和1.19倍（<0.05）。土壤AP和AK對(duì)施肥的響應(yīng)更加敏感，NPK處理的AP和AK相對(duì)于CK分別增加了22.4倍和3.71倍，而NPKM處理則分別增加55.5倍和9.00倍。然而，N處理對(duì)土壤肥力的改善效果微弱，僅TN相對(duì)于CK顯著增加。

表1 長期不同施肥對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。下同。Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments at<0.05. The same below.

2.2 土壤細(xì)菌群落組成

對(duì)所有土壤樣品進(jìn)行MiSeq高通量測序，經(jīng)數(shù)據(jù)分析與優(yōu)化篩選后共獲得了796 528條優(yōu)質(zhì)序列，其中最少序列的樣品為40 979條，最多序列的樣品為55 621條，樣品的平均序列數(shù)為49 783條。為使所有樣品的序列數(shù)在同一水平上進(jìn)行比較，本研究中每個(gè)樣品隨機(jī)抽取40 000條序列用于分析，抽取后這些序列的96.6%可被歸類為細(xì)菌。

長期不同施肥顯著影響旱地紅壤門水平優(yōu)勢菌的相對(duì)豐度（表2）。可以看出，與CK相比，所有施肥處理均顯著降低酸桿菌和芽單胞菌的相對(duì)豐度；NPK和NPKM處理顯著增加變形菌和厚壁菌的相對(duì)豐度，但卻顯著較低了藍(lán)細(xì)菌的相對(duì)豐度，而N處理對(duì)上述三種優(yōu)勢菌的影響完全相反。此外，N和NPK處理顯著增加浮霉菌的相對(duì)豐度，顯著降低擬桿菌的相對(duì)豐度；而NPKM處理卻顯著增加擬桿菌的相對(duì)豐度，并顯著降低綠彎菌和放線菌的相對(duì)豐度。可見，土壤優(yōu)勢菌對(duì)不同施肥的響應(yīng)差異明顯。對(duì)OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行NMDS分析發(fā)現(xiàn)（圖1），各處理樣點(diǎn)在NMDS圖上分異明顯，互不交叉。經(jīng)ANOSIM檢驗(yàn)，任意兩處理之間的差異性均>0.90、<0.05，表明長期不同施肥已顯著改變土壤細(xì)菌群落組成。

2.3 土壤細(xì)菌多樣性

長期不同施肥顯著影響旱地紅壤細(xì)菌多樣性（表3）。與CK相比，N處理顯著降低土壤細(xì)菌多樣性，其物種豐富度、Chao1指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)的降幅分別達(dá)到49.4%、46.7%、40.7%和21.4%；NPK處理也會(huì)顯著降低系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)，其降幅分別達(dá)到10.3%和13.0%；而NPKM處理可顯著提高物種豐富度、Chao1指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)，其增幅分別達(dá)到63.2%、66.9%、41.1%和7.0%。

圖1 細(xì)菌群落組成的NMDS分析

2.4 土壤細(xì)菌群落特征與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)（表4），9種土壤優(yōu)勢菌中有6種（酸桿菌、綠彎菌、放線菌、浮霉菌、擬桿菌和芽單胞菌）的相對(duì)豐度均首先取決于土壤pH，厚壁菌的相對(duì)豐度也受土壤pH的影響，僅變形菌和藍(lán)細(xì)菌的相對(duì)豐度與土壤pH無關(guān)。同樣，土壤pH也是決定物種豐富度、Chao1指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和香農(nóng)指數(shù)的首要因素。土壤肥力狀況（TN、AN、AP等）對(duì)土壤優(yōu)勢菌相對(duì)豐度和細(xì)菌多樣性的影響相對(duì)較弱。

進(jìn)一步通過MRT分析發(fā)現(xiàn)，MRT共解釋了83.1%的細(xì)菌群落變異（圖2）。首先，細(xì)菌群落由土壤pH分為兩支，當(dāng)pH≥4.73時(shí)CK和NPKM處理分在一支，當(dāng)pH<4.73時(shí)N和NPK處理分在一支，此時(shí)pH的解釋率為46.3%。進(jìn)一步地，pH又分別在5.64時(shí)和4.09時(shí)將CK和NPKM處理、N和NPK處理相互分開，pH的解釋率分別為22.4%和14.4%?？梢?，長期不同施肥后旱地紅壤細(xì)菌群落變化主要由土壤pH驅(qū)動(dòng)。

表2 長期不同施肥對(duì)土壤優(yōu)勢菌相對(duì)豐度的影響

表3 長期不同施肥對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響

表4 優(yōu)勢菌相對(duì)豐度、細(xì)菌多樣性與土壤化學(xué)性質(zhì)的逐步回歸分析

注：NS表示沒有與因變量具有顯著相關(guān)性的自變量。Note：NS indicates no independent variable that has significant correlation with dependent variable.

圖2 不同處理土壤細(xì)菌群落的多元回歸樹分析

2.5 顯著差異物種

在細(xì)菌屬水平上進(jìn)行STAMP分析發(fā)現(xiàn)（圖3），N、NPK和NPKM處理相對(duì)于CK分別有11、14和8個(gè)顯著差異細(xì)菌屬。與CK相比，N和NPK處理均顯著降低了和，顯著增加了，而NPKM處理的表現(xiàn)則完全相反。N和NPK處理均顯著增加了、和，而N、NPK和NPKM處理均會(huì)造成、和的顯著降低。

3 討 論

近幾十年來中國農(nóng)田的土壤酸化現(xiàn)象引起了廣泛關(guān)注。Guo等[25]通過大范圍的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，相比1980s，中國大部分農(nóng)田的土壤pH在2000s時(shí)均顯著降低（<0.05）?；瘜W(xué)氮肥的大量投入是造成土壤酸化的主要原因。高溫多雨的氣候特征使得南方紅壤本身就經(jīng)歷緩慢的“自然酸化”過程，土壤呈酸性、鹽基離子大量淋失、有機(jī)質(zhì)含量低，因而更易遭受由施肥引起的“人為酸化”的影響[2]。本研究也證實(shí)，長期施用化學(xué)氮肥急劇加速了紅壤的酸化進(jìn)程，N和NPK處理的土壤pH分別下降至4.02和4.15。土壤在不同的酸化階段，會(huì)經(jīng)歷不同元素的緩沖體系，尤其是當(dāng)pH<4.2時(shí)，土壤進(jìn)入Al緩沖體系使得大量的Al3+被釋放出來[26]。因此，N和NPK處理的地上植物和地下微生物可能已遭受Al毒的危害。而在相同施氮量的基礎(chǔ)上，用有機(jī)氮肥替代70%的化學(xué)氮肥則具有良好的改酸效果。有機(jī)肥的堿度、有機(jī)氮的氨化作用和有機(jī)陰離子的脫羧反應(yīng)是減輕土壤酸度的主要原因[2]。并且，化肥有機(jī)肥配施（NPKM處理）也是改善土壤肥力的有效措施，其效果要明顯優(yōu)于NPK處理，而單施氮肥（N處理）不利于土壤肥力的提升。

紅壤本身呈酸性，長期自然選擇的結(jié)果使嗜酸性的酸桿菌具有較高比重。然而經(jīng)過25 a施肥，NPK和NPKM處理中酸桿菌相對(duì)豐度均顯著降低，變形菌成為最優(yōu)勢種群，其原因既與土壤pH變化有關(guān)，也因?yàn)樗釛U菌屬于典型的貧營養(yǎng)型（即K策略者）細(xì)菌[27]，大量投入的營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)抑制其生長，而變形菌屬于富營養(yǎng)型（即r策略者）細(xì)菌[28]，土壤肥力提升會(huì)促進(jìn)其生長。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)變形菌的相對(duì)豐度與土壤碳含量顯著正相關(guān)，本研究也證實(shí)土壤SOC是影響變形菌相對(duì)豐度的首要因素（表4）。綠彎菌和放線菌對(duì)有機(jī)肥施用非常敏感[29]，Tian等[30]甚至發(fā)現(xiàn)其相對(duì)豐度與有機(jī)肥的施用量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，本研究也發(fā)現(xiàn)NPKM處理顯著降低了綠彎菌和放線菌的相對(duì)豐度。但擬桿菌和厚壁菌不同，Chaudhry等[31]發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥有利于提升其相對(duì)豐度，這與本研究結(jié)果一致。需要注意的是，與CK相比，NPKM處理中厚壁菌的相對(duì)豐度大幅提升了345.9%，且土壤AP的影響居首（表4），Yang等[32]研究也有相似結(jié)果。本研究中，長期單施氮肥僅提高土壤TN含量，未從根本上改善土壤肥力狀況，但也造成了貧營養(yǎng)型的酸桿菌、富營養(yǎng)型的變形菌以及其他一些菌群相對(duì)豐度降低，其原因可能是嚴(yán)重的土壤酸化（N處理土壤pH僅為4.02）對(duì)這些微生物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的環(huán)境脅迫；同樣，擬桿菌通常也被認(rèn)為是富營養(yǎng)型微生物[28]，但其相對(duì)豐度在NPK處理中顯著降低，也是因?yàn)橥寥纏H的脅迫作用超過了肥力改善的促進(jìn)作用（表4）。

每一種微生物都具有獨(dú)特的生態(tài)位和特殊的生態(tài)功能，不同施肥措施造成的顯著差異微生物可以表征特殊的環(huán)境條件，因此具有很強(qiáng)的指示作用。Ward等[33]發(fā)現(xiàn)具有降解土壤中復(fù)雜有機(jī)化合物的能力，Yu等[34]發(fā)現(xiàn)長期秸稈還田顯著增加了紅壤水稻土中的相對(duì)豐度，本研究則證實(shí)長期施用豬糞也會(huì)增加旱地紅壤中的比例，而施用化肥的作用相反，并且受施N、NPK和NPKM的影響效應(yīng)分別居各處理所有顯著差異細(xì)菌屬的第2、1、1位，因此它有可能作為評(píng)價(jià)土壤改良效果的敏感微生物指標(biāo)。、和均屬于變形菌，其生態(tài)功能與土壤中的氮素固定或轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)N和NPK處理顯著增加了他們的相對(duì)豐度，但NPKM處理未表現(xiàn)出相似效果，這可能與它們偏好化學(xué)氮肥施用后的酸性土壤環(huán)境有關(guān)[35]，也可能是因?yàn)镹PKM處理的土壤氮素水平最高限制了它們的生態(tài)功能發(fā)揮[36]。屬于變形菌，和屬于放線菌，各施肥處理均造成它們的相對(duì)豐度降低，表明它們對(duì)施肥極其敏感，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)它們的相對(duì)豐度與TN、AN等土壤養(yǎng)分指標(biāo)呈（極）顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖3 基于STAMP分析的顯著差異細(xì)菌屬

Sun等[13]發(fā)現(xiàn)，長期施用豬糞或牛糞有利于維持砂姜黑土的細(xì)菌群落組成。本研究也發(fā)現(xiàn)，盡管長期不同施肥使旱地紅壤的細(xì)菌群落發(fā)生轉(zhuǎn)變，但CK和NPKM處理仍更相似，N和NPK處理更相似（圖2），并且土壤pH是造成這種結(jié)果的唯一原因，即兩處理細(xì)菌群落相似是因?yàn)樗鼈兙哂邢嘟耐寥纏H[13]。生物多樣性是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，土壤微生物多樣性是土壤質(zhì)量和健康的標(biāo)志。本研究證明施用有機(jī)肥提高了土壤細(xì)菌多樣性，而單施氮肥會(huì)導(dǎo)致其大幅降低。尤其需要注意的是，長期施用化肥氮磷鉀也會(huì)降低土壤細(xì)菌多樣性，而“重化肥輕有機(jī)肥”正是近幾十年來我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的普遍現(xiàn)象。土壤細(xì)菌多樣性的降低，意味著土壤微生物生態(tài)功能的缺失，長期發(fā)展下去勢必會(huì)影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)力。逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)（表4），決定細(xì)菌多樣性的首要因素也是土壤pH。

由上述分析可以看出，經(jīng)過25 a的長期施肥，雖然NPK和NPKM處理顯著改善了旱地紅壤的土壤肥力，尤其是土壤的速效養(yǎng)分含量（如AP）得到極大提升，但影響土壤優(yōu)勢菌相對(duì)豐度、細(xì)菌群落組成和多樣性的首要因素仍是土壤pH，這與許多研究[7-10]認(rèn)為是施肥造成的養(yǎng)分變化直接驅(qū)動(dòng)了微生物群落轉(zhuǎn)變的觀點(diǎn)不同。造成這種不一致的主要原因是土壤pH的變化幅度，Xun等[37]提出了“橄欖球模型”來解釋這種現(xiàn)象：即土壤在近中性環(huán)境（以橄欖球的中部表征），土壤養(yǎng)分對(duì)細(xì)菌群落的轉(zhuǎn)變有較強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)作用（橄欖球中部的橫截面半徑較大，以此表征養(yǎng)分指標(biāo)驅(qū)動(dòng)作用的強(qiáng)度和方向），隨著土壤酸化或堿化的加?。ㄒ蚤蠙烨虻膬啥吮碚鳎?，土壤pH對(duì)細(xì)菌群落轉(zhuǎn)變的影響越來越大，而土壤養(yǎng)分的作用被逐漸限制（趨向兩端，橄欖球橫截面的半徑縮小）。在本研究中，不同施肥使得旱地紅壤pH發(fā)生了顯著變化，尤其是長期單施化肥急劇加速了土壤酸化，土壤甚至已經(jīng)進(jìn)入到危害嚴(yán)重的Al緩沖體系，土壤酸化的負(fù)面效應(yīng)已遠(yuǎn)超肥力改善的正面效應(yīng)。而化肥有機(jī)肥配施在補(bǔ)充土壤養(yǎng)分的同時(shí)，也明顯改善了土壤酸度，更促進(jìn)了土壤養(yǎng)分正面效應(yīng)的充分發(fā)揮。

本研究側(cè)重考察了長期施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落組成和多樣性的影響，這對(duì)于評(píng)估生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有指導(dǎo)意義，但就土壤生態(tài)功能發(fā)揮而言，土壤微生物的數(shù)量及活性等也至關(guān)重要，這有待將來進(jìn)一步研究完善。此外，細(xì)菌雖然是土壤中種類最多、數(shù)量最大且目前研究最廣泛的一類微生物，但也不能忽視土壤中其他重要的微生物類群（如古菌、真菌等）以及具有特殊功能的微生物類群（如固氮菌、硝化細(xì)菌、解磷菌等），將來也有必要利用高通量測序技術(shù)研究它們對(duì)長期施肥的響應(yīng)，這樣才能更全面、真實(shí)地了解施肥措施對(duì)旱地紅壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。

4 結(jié) 論

長期施用化肥嚴(yán)重加劇旱地紅壤酸化，化肥有機(jī)肥配施不僅大幅降低土壤酸度，而且對(duì)土壤肥力的改善效果最好。不同施肥措施使旱地紅壤細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化，長期施用化肥降低了土壤細(xì)菌多樣性，而化肥有機(jī)肥配施明顯提高細(xì)菌多樣性。經(jīng)分析確定，土壤pH是影響旱地紅壤細(xì)菌群落的關(guān)鍵因素，土壤肥力的作用相對(duì)較弱，長期施用化學(xué)氮肥造成的紅壤酸化的負(fù)面效應(yīng)已遠(yuǎn)超肥力改善的正面效應(yīng)。因此，旱地紅壤施肥應(yīng)以防治土壤酸化為前提，化肥有機(jī)肥配施是一項(xiàng)適宜的施肥措施。

［1］ Huang G Q，Zhao Q G. Initial exploration of red soil ecology. Acta Ecologica Sinica，2014，34（18）：5173—5181. [黃國勤，趙其國. 紅壤生態(tài)學(xué). 生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，34（18）：5173—5181.]

［2］ Liu J，Liu M，Wu M，et al. Soil pH rather than nutrients drive changes in microbial community following long-term fertilization in acidic Ultisols of Southern China. Journal of Soils and Sediments，2018，18（5）：1853—1864.

［3］ Xin X L，Qin S W，Zhang J B，et al. Yield，phosphorus use efficiency and balance response to substituting long-term chemical fertilizer use with organic manure in a wheat-maize system. Field Crops Research，2017，208：27—33.

［4］ Duan Y H，Xu M G，Gao S D，et al. Nitrogen use efficiency in a wheat–corn cropping system from 15 years of manure and fertilizer applications. Field Crops Research，2014，157：47—56.

［5］ Liu J，Chen J R，Xie J，et al. Effects of nitrogen application time on biomass and nitrogen accumulation of peanut in upland red soil. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2017，39（4）：515—523. [劉佳，陳靜蕊，謝杰，等. 不同施氮時(shí)期對(duì)紅壤旱地花生生物量和氮素累積的影響. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2017，39（4）：515—523.]

［6］ Ku?lien? G，Rasmussen J，Kuzyakov Y，et al. Medium-term response of microbial community to rhizodeposits of white clover and ryegrass and tracing of active processes induced by13C and15N labelled exudates. Soil Biology& Biochemistry，2014，76：22—33.

［7］ Chen X F，Li Z P，Liu M，et al. Microbial community and functional diversity associated with different aggregate fractions of a paddy soil fertilized with organic manure and/or NPK fertilizer for 20 years. Journal of Soils and Sediments，2015，15（2）：292—301.

［8］ Xia X，Shi K，Huang Q R，et al. The changes of microbial community structure in red paddy soil under long-term fertilization. Acta Pedologica Sinica，2015，52（3）：697—705. [夏昕，石坤，黃欠如，等. 長期不同施肥條件下紅壤性水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)的變化. 土壤學(xué)報(bào)，2015，52（3）：697—705.]

［9］ Zhang Q，Zhou W，Liang G Q，et al. Distribution of soil nutrients，extracellular enzyme activities and microbial communities across particle-size fractions in a long-term fertilizer experiment. Applied Soil Ecology，2015，94：59—71.

［10］ Zhong W H，Gu T，Wang W，et al. The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity. Plant and Soil，2010，326（1/2）：511—522.

［11］ Xun W B，Zhao J，Xue C，et al. Significant alteration of soil bacterial communities and organic carbon decomposition by different long-term fertilization management conditions of extremely low-productivity arable soil in South China. Environmental Microbiology，2016，18（6）：1907—1917.

［12］ Zeng J，Liu X J，Song L，et al. Nitrogen fertilization directly affects soil bacterial diversity and indirectly affects bacterial community composition. Soil Biology & Biochemistry，2016，92：41—49.

［13］ Sun R B，Zhang X X，Guo X S，et al. Bacterial diversity in soils subjected to long-term chemical fertilization can be more stably maintained with the addition of livestock manure than wheat straw. Soil Biology & Biochemistry，2015，88：9—18.

［14］ Ma X Y，Liu M，Li Z P. Shifts in microbial biomass and community composition in subtropical paddy soils under a gradient of manure amendment. Biology and Fertility of Soils，2016，52（6）：775—787.

［15］ Xia W W，Jia Z J. Comparative analysis of soil microbial communities by pyrosequencing and DGGE. Acta Microbiologica Sinica，2014，54（12）：1489-1499. [夏圍圍，賈仲君. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評(píng)價(jià). 微生物學(xué)報(bào)，2014，54（12）：1489—1499.]

［16］ Liu K L，Huang J，Zhang H M，et al. Effect of long-term fertilization on aggregation characteristics and distribution of potassium fractions in red soil. Acta Pedologica Sinica，2018，55（2）：443—454. [柳開樓，黃晶，張會(huì)民，等. 長期施肥對(duì)紅壤旱地團(tuán)聚體特性及不同組分鉀素分配的影響. 土壤學(xué)報(bào)，2018，55（2）：443—454.]

［17］ Cai Z J，Wang B R，Xu M G，et al. Intensified soil acidification from chemical N fertilization and prevention by manure in an 18-year field experiment in the red soil of Southern China. Journal of Soils and Sediments，2015，15（2）：260—270.

［18］ Lu R K. Analytical methods for soil and agro-chemistry. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2000. [魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000.]

［19］ Biddle J F，F(xiàn)itz-Gibbon S，Schuster S C，et al. Metagenomic signatures of theMargin subseafloor biosphere show a genetically distinct environment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（30）：10583—10588.

［20］ Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods，2010，7（5）：335—336.

［21］ Sun R B，Guo X S，Wang D Z，et al. The impact of long-term application of chemical fertilizers and straw returning on soil bacterial community. Microbiology China，2015，42（10）：2049—2057. [孫瑞波，郭熙盛，王道中，等. 長期施用化肥及秸稈還田對(duì)砂姜黑土細(xì)菌群落的影響. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（10）：2049—2057.]

［22］ Clarke K R. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Austral Ecology，1993，18（1）：117—143.

［23］ De’Ath G. Multivariate regression trees：A new technique for modeling species–environment relationships. Ecology，2002，83（4）：1105—1117.

［24］ Parks D H，Tyson G W，Hugenholtz P，et al. STAMP：Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics，2014，30（21）：3123—3124.

［25］ Guo J H，Liu X J，Zhang Y，et al. Significant acidification in major Chinese croplands. Science，2010，327（5968）：1008—1010.

［26］ Ulrich B. Natural and anthropogenic components of soil acidification. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，1986，149（6）：702—717.

［27］ Fierer N，Lauber C L，Ramirez K S，et al. Comparative metagenomic，phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities across nitrogen gradients. The ISME Journal，2012，6（5）：1007—1017.

［28］ Fierer N，Bradford M A，Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology，2007，88（6）：1354—1364.

［29］ Sun J，Zhang Q，Zhou J，et al. Pyrosequencing technology reveals the impact of different manure doses on the bacterial community in apple rhizosphere soil. Applied Soil Ecology，2014，78：28—36.

［30］ Tian W，Zhang Z H，Hu X F，et al. Short-term changes in total heavy metal concentration and bacterial community composition after replicated and heavy application of pig manure-based compost in an organic vegetable production system. Biology and Fertility of Soils，2015，51（5）：593—603.

［31］ Chaudhry V，Rehman A，Mishra A，et al. Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments. Microbial Ecology，2012，64（2）：450—460.

［32］ Yang Y R，Li X G，Liu J G，et al. Bacterial diversity as affected by application of manure in red soils of subtropical China. Biology and Fertility of Soils，2017，53（6）：639—649.

［33］ Ward N L，Challacombe J F，Janssen P H，et al. Three genomes from the Phylum acidobacteria provide insight into the lifestyles of these microorganisms in soils. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（7）：2046—2056.

［34］ Yu Y J，Wu M，Petropoulos E，et al. Responses of paddy soil bacterial community assembly to different long-term fertilizations in southeast China. Science of the Total Environment，2019，656：625—633.

［35］ van den Heuvel R N，van der Biezen E，Jetten M S M，et al. Denitrification at pH 4 by a soil-derived-dominated community. Environmental Microbiology，2010，12（12）：3264—3271.

［36］Ikeda S，Sasaki K，Okubo T，et al. Low nitrogen fertilization adapts rice root microbiome to low nutrient environment by changing biogeochemical functions. Microbes and Environments，2014，29（1）：50—59.

［37］ Xun W B，Huang T，Zhao J，et al. Environmental conditions rather than microbial inoculum composition determine the bacterial composition，microbial biomass and enzymatic activity of reconstructed soil microbial communities. Soil Biology & Biochemistry，2015，90：10—18.

Effects of Long-Term Fertilization on Bacterial Community in Upland Red Soil

LIU Jia1, 2, 3, CHEN Xiaofen1, 2, 3, LIU Ming1, WU Meng1, WANG Boren4, 5, CAI Zejiang4, 5, ZHANG Taolin1, 2, LI Zhongpei1, 2?

(1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Soil and Fertilizer & Resources and Environment Institute,Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, National Engineering & Technology Research Center for Red Soil Improvement, Nanchang 330200, China; 4.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 5. National Observation Station of Qiyang Agro-ecology System, Qiyang,Hunan 426182,China)

Fertilization is an effective measure to improve soil fertility and increase crop yield in red soil. As important components of a soil ecosystem, soil microorganisms play an essential role in soil fertility formation, organic matter decomposition, and nutrient biogeochemical recycling as well. However, though soil microorganisms are very sensitive to fertilization, limited information is available in the literature about effects of fertilization on the microbial community in upland red soil. The objective of this study is to investigate responses of the bacterial community in upland red soil to long-term fertilization varying in strategy, and to provide a theoretical basis for rational fertilization and sustainable utilization of the red soil in South China.In this study, a long-term field fertilization experiment (established in 1990) on winter wheat–summer maize rotation at the Qiyang Red Soil Experimental Station of the Chinese Academy of Agricultural Sciences was carried out.The experiment had four treatments, i.e. no fertilizer (CK), only application of chemical nitrogen fertilizer (N), application of chemical nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer (NPK), and application of NPK plus manure (NPKM). Except CK, all the treatments

N 300 kg·hm–2·a–1, and the N in Treatment NPKM had 30% coming from chemical fertilizer and the rest from manure. Samples of surface soil (0～20 cm) were collected in May 2015 (after wheat was harvested and before maize was planted). The technology of high-throughput sequencing of the V4-V5 16S rRNA gene region were used to determine composition and diversity of the soil bacterial community in the samples, and then to identify key factors affecting the bacterial community in the upland red soil.Results show: (1) Long-term fertilization significantly changed chemical properties of the upland red soil. Compared with CK, Treatments N and NPK declined significantly or down to 4.02 and 4.15, respectively, in soil pH, while Treatment NPKM increased significantly or up to 5. 99. Both NPK and NPKM significantly improved soil fertility, but the effect of the latter was much better than the former. However, Treatment N only increased soil TN content, which was not conducive to soil fertility; (2) Long-term fertilization affected relative abundance of the soil dominant bacteria at the phylum level. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) and similarity analysis (ANOSIM) shows that soil bacterial communities in the treatments varied significantly; (3) Compared with CK, Treatment N was 21.4%～49.4% lower in the four diversity indices (observed species, Chao1 index, phylogenetic diversity and Shannon index), while Treatment NPKM was 7.0%～66.9% higher. Besides, Treatment NPK was 10.3% and 13.0% lower, respectively in phylogenetic diversity and Shannon index; (4) Stepwise regression analysis shows that soil pH was the primary factor determining relative abundance of the dominant soil bacterial phyla and four diversity indices of the soil bacterial community. Furthermore, multivariate regression tree (MRT) analysis shows that soil pH explained 83.1% of the detected variation of the soil bacterial communities between the treatments, and differentiation of the bacterial community was driven by soil pH; and (5) Compared with CK, statistical analysis of metagenomic profiles (STAMP) shows that Treatment N, NPK and NPKM had 11, 14 and 8 treatment-specific bacterial genera, respectively.In conclusion, the bacterial community in the upland red soil following long-term fertilization is mainly affected by soil pH, and the negative effects of soil acidification induced by long-term fertilization may have far exceeded the positive effects of fertility improvement. Therefore, fertilization in upland red soil should be based on the premise of prevention of soil acidification, and combined application of chemical fertilizer and manure is a suitable fertilization measure.

Long-term fertilization; Upland red soil; Bacterial community; High-throughput sequencing; Soil pH

S154.3

A

10.11766/trxb201810090507

劉佳，陳曉芬，劉明，吳萌，王伯仁，蔡澤江，張?zhí)伊郑钪遗? 長期施肥對(duì)旱地紅壤細(xì)菌群落的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2020，57（2）：468–478.

LIU Jia，CHEN Xiaofen，LIU Ming，WU Meng，WANG Boren，CAI Zejiang，ZHANG Taolin，LI Zhongpei. Effects of Long-Term Fertilization on Bacterial Community in Upland Red Soil[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（2）：468–478.

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41661052，31660599）、國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2014CB441003）和“一三五”計(jì)劃和領(lǐng)域前沿項(xiàng)目（ISSASIP1642）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos. 41661052 and 31660599），the National Basic Research Program（973 Program）of China（No. 2014CB441003）and the “135”Plan and Field Frontier Project（No. ISSASIP1642）

，E-mail：zhpli@issas.ac.cn

劉 佳（1984—），男，安徽六安人，博士研究生，主要從事紅壤酸化及有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化研究。E-mail：liujia422@126.com

2018–10–09；

2019–01–20；

優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2019–02–26

（責(zé)任編輯：盧 萍）