精液稀釋液的配制及檢測(cè)

吳德標(biāo)

（江蘇省鹽城市鹽都區(qū)家畜改良站，江蘇 鹽城 224056）

豬精液稀釋液的質(zhì)量關(guān)系到豬精子的體外存活時(shí)間。在授精環(huán)節(jié)中豬精液稀釋液的配制、消毒及檢測(cè)工作都影響著授精效果。

1 配方與藥品

葡萄糖—檸檬酸鈉液是一種較簡(jiǎn)單的稀釋液配方。配置稀釋液的藥物原料要純凈，盡可能選用化學(xué)純和分析純制劑。

1.1 葡萄糖 葡萄糖補(bǔ)充精子代謝過程中消耗的能量。精子代謝是單純的分解作用，只能利用簡(jiǎn)單的能量物質(zhì)，葡萄糖即是其中之一。配制精液稀釋液以用注射用葡萄糖為好，比例占5%～6%。

1.2 檸檬酸鈉 檸檬酸鈉是緩沖物質(zhì)，用于維持精液相對(duì)恒定的pH 值，避免精子代謝產(chǎn)物影響精液品質(zhì)。市售品有檸檬酸三鈉或枸櫞酸鈉，本品用量較小，以用分析純?yōu)楹?，比例?.3%～0.5%。

1.3 乙二胺四乙酸二鈉 本品有保護(hù)精子抗冷休克的作用，能改變精子細(xì)胞膜的通透力，降低精子的果糖分解，抑制精子的活動(dòng)，延長(zhǎng)精子的壽命，同時(shí)它也是一種螯合劑，可使精液稀釋液所含不利于精子存活的一些金屬離子變成穩(wěn)定的絡(luò)合物，減少對(duì)精子的傷害。本品以用分析純?yōu)楹?，比例?.1%。

1.4 水 宜用純凈、新鮮的蒸餾水，水質(zhì)決定稀釋液的質(zhì)量。蒸餾水可自制，要符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 抗生素 精液難免被細(xì)菌等有害微生物污染，因此稀釋時(shí)須加入抗菌物質(zhì)抑制有害微生物生長(zhǎng)繁殖。實(shí)踐證明慶大霉素能抑制細(xì)菌，且對(duì)精子無傷害，用量為1萬國際單位/100 mL。

2 藥物稱量和溶解

配置稀釋液用天平稱取藥品，用量杯量取水。需注意的是稱、量一定要準(zhǔn)確，所有藥品必須充分溶解，特別是乙二胺四乙酸二鈉和檸檬酸鈉等較難溶解的藥品。

配制分兩步進(jìn)行，第一步將所稱藥品放入錐形瓶?jī)?nèi)，加入適量蒸餾水后加熱使之充分溶解；第二步再加入蒸餾水定容到所需量，并充分?jǐn)嚢?。配置好的稀釋液須過濾掉所有雜質(zhì)。

3 稀釋液消毒

稀釋液是一種培養(yǎng)基，配置好的稀釋液必須嚴(yán)格滅菌，可采用高壓消毒鍋對(duì)稀釋液進(jìn)行消毒滅菌。

滅菌時(shí)將稀釋液裝入500 mL潔凈的鹽水瓶，塞上瓶塞并用紗布包裹扎緊，再放入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，擰緊環(huán)狀壓蓋螺帽，關(guān)閉放氣閥，接通電源加熱。當(dāng)壓力升到0.3 kg/cm2時(shí)打開放氣閥，放出高壓鍋內(nèi)冷氣，讓指針回落到零位，然后再關(guān)閉放氣閥，繼續(xù)加熱。當(dāng)壓力重新上升到0.7 kg/cm2時(shí)，鍋內(nèi)溫度已達(dá)到115 ℃，可控制電源開關(guān)維持鍋內(nèi)的壓力和溫度，使恒溫恒壓維持半小時(shí)，然后打開放氣閥緩慢放氣，使指針回落到零位，最后打開鍋蓋，取出稀釋液冷卻備用。

4 稀釋液檢測(cè)

消毒稀釋液檢測(cè)合格后方能使用。檢測(cè)方法有二種：

4.1 pH 值測(cè)定 稀釋液pH 值的變化對(duì)精子的活力和代謝有很大影響。18～20 ℃條件下，pH值為6.4 的精子處于可逆的“休眠”狀態(tài)，所以稀釋液的pH值宜在6.4～6.5之間。

稀釋液pH值應(yīng)在稀釋液消毒后溫度降至室溫時(shí)測(cè)定?？捎胮H 6～8的精密試紙測(cè)定稀釋液pH值，稀釋液滴在試紙上半秒鐘內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)比色板比較，得出pH值。有條件的可用酸度計(jì)測(cè)定，用酸度計(jì)測(cè)定時(shí)要注意校正溫度并正確進(jìn)行酸度計(jì)的標(biāo)定，以免引起誤差。

4.2 滲透壓測(cè)定 通常要求稀釋液與精液保持等滲，滲透異常會(huì)影響精子的代謝和活力，低滲比高滲的危害大。

用貝克曼溫度計(jì)（示差溫度計(jì)）來測(cè)定稀釋液的冰點(diǎn)下降度（△t），再除以常數(shù)1.86，計(jì)算出克分子濃度（即滲透壓）。純水在0 ℃開始結(jié)冰，0 ℃是純水的冰點(diǎn)，但水中溶有其他物質(zhì)時(shí)，其在0 ℃以下的某個(gè)溫度開始結(jié)冰，隨溶質(zhì)濃度升高，結(jié)冰的溫度逐步降低，純水冰點(diǎn)與溶液冰點(diǎn)的差為冰點(diǎn)下降度，常用“△t”表示。

用貝克曼溫度計(jì)測(cè)定豬精液稀釋液滲透壓的操作步驟如下：

4.2.1 器材準(zhǔn)備 需準(zhǔn)備的器材有貝克曼溫度計(jì)，滴定臺(tái)，1 000 mL 量杯，冰若干，粗鹽若干，鐵絲圈，20×15試管若干支。

4.2.2 溫度計(jì)調(diào)整 貝克曼溫度計(jì)是長(zhǎng)56 cm 的玻璃管制成的，玻璃內(nèi)部上下各有一個(gè)水銀泡，中間有0～5 的刻度，每一刻度又分成100 等份，上端水銀泡為—U狀細(xì)管，內(nèi)有貯備水銀，通過球狀閥與下端水銀泡相通，以便調(diào)節(jié)下端水銀泡水銀的多少。

調(diào)整時(shí)手握溫度計(jì)，使溫度計(jì)傾斜呈倒置狀態(tài)，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)溫度計(jì)，使U型管中的水銀與溫度計(jì)頂端的球形閥相接，然后另一手握住下端水銀泡（溫度計(jì)處于倒置狀態(tài)，此時(shí)下端水銀泡在上方），借助手溫使水銀柱上升并通過球形閥與U型管中的貯備水銀接通。水銀的多少調(diào)節(jié)好后，左手握溫度計(jì)的上部，右手中指輕擊溫度計(jì)，使U型管中的水銀與球狀閥連接點(diǎn)斷開。

4.2.3 溫度計(jì)安裝 溫度計(jì)調(diào)整好后固定在滴定架上。溫度計(jì)的下方裝有一個(gè)可以上下移動(dòng)的1 000 mL量杯，量杯中放置冰塊，冰塊上撒些粗鹽，將20×15試管置于冰塊中待用。

4.2.4 測(cè)定純水冰點(diǎn) 試管中加入待測(cè)的蒸餾水，水量以能浸沒溫度計(jì)下端水銀泡為度。將鐵絲圈放入試管中，并將溫度計(jì)下端水銀泡插入試管的水中浸沒。隨后用鐵絲圈上下攪動(dòng)試管中的蒸餾水，使溫度均勻下降。

溶液結(jié)冰的瞬間會(huì)釋放出能量，因此，當(dāng)試管中的水開始結(jié)冰時(shí)，水銀柱會(huì)停止下降而突然上升。水銀柱停留在某一刻度不再上升時(shí)，讀取的數(shù)值即為純水的冰點(diǎn)。

貝克曼溫度計(jì)上的刻度不是實(shí)際溫度，而是所測(cè)溶液冰點(diǎn)的相對(duì)刻度值（即貝克曼溫度計(jì)零點(diǎn)），而其零點(diǎn)與下端水銀泡中的水銀多少有關(guān)，所以每進(jìn)行一批次測(cè)定都要重新調(diào)整溫度計(jì)。連續(xù)測(cè)定三次純水冰點(diǎn)，讀數(shù)末位之差不超過3時(shí)，取其平均值，超過3時(shí)應(yīng)重做。

4.2.5 測(cè)定精液與稀釋液 測(cè)得純水冰點(diǎn)后，進(jìn)行稀釋液（或精液）的測(cè)定，測(cè)定方法同上。測(cè)定完畢取出貝克曼溫度計(jì)時(shí)，往往試管中的溶液已結(jié)冰，此時(shí)要待冰融化后再將溫度計(jì)取出，切勿硬拉。每測(cè)完一種溶液后，需將溫度計(jì)下端擦拭干凈，所用試管應(yīng)先用被測(cè)溶液沖洗一下，以免影響測(cè)定結(jié)果。貝克曼溫度計(jì)使用完畢，應(yīng)擦拭干凈并倒置，使下端水銀泡中的水銀向U型管中回流一些，然后置盒中保存。

4.2.6 計(jì)算冰點(diǎn)下降度 純水三次冰點(diǎn)平均值：t，所測(cè)溶液三次冰點(diǎn)平均值：t′，冰點(diǎn)下降度△t＝t-t′。