基于微流控芯片對流感嗜血桿菌的快速檢測

高菊逸 吳傳安 楊偉康 羅裕旋 徐小平

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HI）是一種沒有運動能力的革蘭陰性（G-）小桿菌，關(guān)于兒童社區(qū)獲得性肺炎的大量研究證明，HI是引起細(xì)菌性肺炎較為常見的病原體之一，僅次于肺炎鏈球菌。根據(jù)HI莢膜多糖抗原的不同，可將其分為6個血清型（a～f型），其中 b型 HI（又稱乙型 HI）是引起 5歲以下兒童細(xì)菌性腦膜炎的主要原因［1-4］。近年來，不少研究顯示HI在免疫人群中的感染率也在不斷地上升，不可分型的HI成為引起呼吸道感染的主要原因之一［3］。因此，研究一種快速經(jīng)濟的檢測方法對于HI的早期鑒定及診斷具有重要的研究意義。

隨著科技的不斷發(fā)展，微流控芯片技術(shù)的集成化、小型化、高通量等特點在細(xì)菌檢測中凸顯優(yōu)勢［5-8］。本研究利用微流控芯片的以上特點建立了一種針對HI的快速檢測技術(shù)平臺，可在30 min內(nèi)完成檢測，且該方法具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 HI ATCC49247，肺炎克雷伯菌（香港大學(xué)深圳醫(yī)院微生物科提供）。

1.2 儀器與試劑 對準(zhǔn)型光刻機（韓國Midas公司），表面輪廓儀（中國威爾量儀公司），等離子清洗儀（成都銘恒公司），SU8光刻膠（美國Microchem公司），三甲基氯硅烷（德國ABCR公司），聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS，美國 Dow Coring公司），環(huán)烯烴聚合物（cycloolefin polymer, COP，美國Dow Coring公司），OCA（optically clear adhesive）光學(xué)透明膠（3M中國有限公司），倒置熒光顯微鏡（日本尼康儀器有限公司）；EC肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱公司）。

1.3 微流控芯片的設(shè)計制作及抗體固定 采用計算機輔助軟件（Auto CAD）設(shè)計芯片通道及內(nèi)部魚骨結(jié)構(gòu)，通道長 120 mm，寬 30 μm，魚骨每段長 60 μm，寬30 μm，高10 μm。根據(jù)設(shè)計的圖形制作掩膜，取干凈硅片進行等離子清洗，旋涂SU8-3025光刻膠制作通道模板，同樣操作使用SU8-3010光刻膠制作魚骨模板，再使用三甲基氯硅烷進行硅烷化處理，5 min后倒入1：10 PDMS 184后水平靜置30 min，置于80 ℃電熱干燥箱烘烤30 min。將制作好的PDMS模板在120 ℃下壓印在COP上，最后采用雕刻好的OCA光學(xué)透明膠將上下兩層COP進行不可逆的鍵合，放入80 ℃電熱干燥箱烘烤10 min，芯片制作完成。通過注射泵控制反應(yīng)通道內(nèi)反應(yīng)液的流動，利用巰基-馬來酰亞胺基團硅烷化偶聯(lián)法，對反應(yīng)檢測區(qū)進行表面修飾和抗體固定［9-10］。

1.4 細(xì)菌菌懸液的配制 將HI過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯菌懸液0.2 mL，使用無菌生理鹽水配制成濃度為1.5×104cfu/mL的菌液，通過平板菌落計數(shù)確定濃度。使用無菌生理鹽水倍比稀釋到1.5×103、1.5×102、1.5×101cfu/mL，共 4 個濃度，每個濃度各取1 mL菌液，沸水中煮30 min滅活后離心備用。肺炎鏈球菌ATCC49619、肺炎克雷伯菌按上述同樣方法制備菌懸液備用。以高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）為陰性對照。

1.5 檢測方法

1.5.1 選擇最佳進樣流速和進樣時間 根據(jù)芯片設(shè)計的尺寸及檢測樣本的不同確定最佳進樣流速和進樣時間，參照本團隊之前的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進行調(diào)整［11］，最終選擇 4 個進樣流速（2、4、6、8 μL/min）進行調(diào)試對比，每間隔5 min記錄1次熒光信號強度值，直至60 min。

1.5.2 樣品檢測 取5 μL FITC標(biāo)記羊抗HI抗原單克隆抗體，以上述實驗中確定的最佳進樣速度通入芯片內(nèi)，反應(yīng)30 min后用PBS沖洗，再將20 μL制備好的待測樣品通入芯片，30 min后用PBS沖洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察芯片檢測區(qū)域內(nèi)的熒光信號，并使用高速電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）拍照記錄（20倍放大，曝光時間為1.25 s），采用Image-Pro Plus 5.0軟件分析各檢測區(qū)域的熒光信號強度。

1.5.3 檢測芯片的檢測限和特異性 將1.4項中制備的濃度為1.5×101～1.5×104cfu/mL的HI菌懸液分別以最佳進樣流速和進樣時間通入芯片內(nèi)，以PBS作為陰性對照，在顯微鏡下觀察并記錄數(shù)據(jù)，利用公式：捕獲率＝入口細(xì)菌濃度/出口細(xì)菌濃度×100%，計算對細(xì)菌的捕獲率，得出芯片的檢測限。將不同濃度肺炎鏈球菌ATCC49619、肺炎克雷伯菌按上述方法進行檢測。采用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進行獨立樣本t檢驗，確定該微流控芯片的特異性。

1.5.4 檢測芯片與平板培養(yǎng)法結(jié)果的總符合率 取30份濃度為1.5×103cfu/mL的HI菌懸液作為待測樣本，30份無菌PBS作為陰性對照，分別進行平板過夜培養(yǎng)及芯片檢測，計算微流控芯片的靈敏度及其與平板培養(yǎng)法的總符合率。

2 結(jié)果

2.1 微流控芯片的制作及優(yōu)勢 本研究根據(jù)HI的特性，在流體通道中增設(shè)了魚骨結(jié)構(gòu)，有效加大了HI與抗體的接觸面積，并且通過阻力效應(yīng)增加了HI與抗體反應(yīng)的時間，顯著提高了芯片的檢測效率。

另外，HI大小僅為0.3～0.4 μm×1.5 μm，芯片內(nèi)檢測通道的高度對檢測結(jié)果的影響重大，如果通道過高可能會導(dǎo)致HI無法接觸表面抗體從而降低檢出率，所以芯片的高度設(shè)計對其檢測結(jié)果至關(guān)重要。本研究制作完成的芯片利用表面輪廓儀測量高度為24.870 μm，其中魚骨高10 μm，將通道高度有效減少到了14.870 μm，對于HI的檢出提供了有力的支持。見圖1～2。

2.2 確定最佳進樣流速和時間 不同流速下反應(yīng)區(qū)域熒光信號強度變化見圖3。當(dāng)流速為2 μL/min時，反應(yīng)區(qū)的熒光信號強度于1 h時可達到最高；當(dāng)流速為4 μL/min時，熒光信號強度仍然保持高水平，達到最高值只需要30 min，并且存在較長時間的穩(wěn)定期，有利于提高芯片內(nèi)細(xì)菌檢測的穩(wěn)定性，之后當(dāng)流速逐漸增快時，反應(yīng)區(qū)內(nèi)的熒光信號強度逐漸減弱。最終選擇4 μL/min和30 min為最佳進樣速度和反應(yīng)時間。流速為4 μL/min時，芯片檢測反應(yīng)區(qū)的熒光信號見圖4。

圖1 1A為微流控芯片實物圖，1B為顯微鏡下40倍放大魚骨設(shè)計圖

圖2 微流控芯片內(nèi)通道高度（精確到0.000 μm）

圖3 不同進樣流速下反應(yīng)區(qū)熒光強度隨時間變化曲線

圖4 微流控芯片檢測反應(yīng)區(qū)熒光信號強度圖（40倍放大）

圖5 不同濃度HI菌懸液通過微流控芯片檢測反應(yīng)區(qū)的熒光信號強度圖（40倍放大）

2.3 檢測限 當(dāng)HI濃度為1.5×104cfu/mL時，通道內(nèi)對HI的捕獲率明顯較高，隨著濃度的不斷降低，捕獲率也隨之減少，當(dāng)濃度為1.5×101cuf/mL時，通道內(nèi)無法檢測到熒光信號，捕獲率為0。見圖5。不同濃度HI菌懸液通過微流控芯片的捕獲率比較見圖6。根據(jù)捕獲率及熒光強度確定本方法對HI的檢測限為102cfu/mL。

圖6 不同濃度HI菌懸液通過微流控芯片的捕獲率

2.4 特異性 HI的捕獲率為95%，明顯高于肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌（捕獲率均為0），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t1＝5.114，t2＝5.001，均 P＜0.01），證明此方法對HI的特異性為100%。

2.5 符合率 根據(jù)表1內(nèi)數(shù)據(jù)計算芯片的靈敏度為90%（27/30），與平板培養(yǎng)法相比，總符合率為95%（57/60）。

表1 微流控芯片檢測法與平板培養(yǎng)檢測法結(jié)果比較

3 討論

HI不僅是引起兒童呼吸道感染的常見病原菌，也是導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的主要原因［12］。長期以來，國內(nèi)外對HI開展了大量的研究，并已成功將分子生物學(xué)、質(zhì)譜等新技術(shù)應(yīng)用于HI的檢測［13］，但絕大部分是針對侵襲力較強的b型HI。目前臨床上針對HI的檢測方法較多，但仍然存在檢測方法復(fù)雜、試劑成本較高、檢測時間較長等缺點，且二級及以下醫(yī)院及社區(qū)健康醫(yī)療服務(wù)中心無法滿足設(shè)備與試劑需求，尚未有能力開展分子診斷及質(zhì)譜診斷。針對以上不足，陶冶等［14］研制了一種膠體金試紙，以HI外膜蛋白P6為檢測標(biāo)志物，基于雙抗體夾心免疫層系技術(shù)，可在15 min內(nèi)完成檢測，檢測限為1×105cfu/mL，此方法雖然實現(xiàn)了快速檢測，但檢測限較高，容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。

近年來，微流控芯片的小型化、集成化特點在藥品檢測、腫瘤富集檢測、微生物多重耐藥檢測等醫(yī)學(xué)研究方面顯示出特有的優(yōu)勢［15］。文小霞等［16］研制的微流控芯片能在15 h內(nèi)完成細(xì)菌鑒定，檢測限可達103cfu/mL，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法的一致性達到96.3%。本研究制作的這款微流控芯片與其相比縮短了檢測時間，在設(shè)計時增加的魚骨結(jié)構(gòu)能夠有效將通道高度與HI大小匹配，經(jīng)實驗驗證，該芯片靈敏度為90%，特異性為100%，與平板培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較，總符合率為95%。微流控芯片與臨床上現(xiàn)有的檢測方法相比，大幅度降低了樣本和試劑的使用量，有效減少了檢測時間，為臨床早期治療疾病提供了有力的診斷依據(jù)，適用于基層醫(yī)療單位及社區(qū)健康醫(yī)療服務(wù)中心，應(yīng)用較為廣泛。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突