姜黃素和萬古霉素對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放百分率及丙二醛的影響

羅潔，徐芬，丁嵐

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗(yàn)教研室，江西 上饒33400）

萬古霉素自上市以來，已成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的首選治療藥物[1]，但與此同時(shí),中毒性腎損傷的副作用也日益成為臨床醫(yī)師在使用萬古霉素時(shí)有所顧慮的重要原因,從而限制其臨床應(yīng)用[2]。近年來的研究表明，氧化應(yīng)激機(jī)制為萬古霉素所致腎毒性的主要機(jī)制[3]。姜黃素（Curcumin）是提取自姜黃、郁金、莪術(shù)等植物塊莖中的一種天然活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等多種藥理作用,其中抗氧化作用的主要機(jī)制被認(rèn)為與清除自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性有關(guān)，因此被當(dāng)作一種天然的抗氧劑[4]。目前尚無有關(guān)研究針對(duì)姜黃素是否對(duì)萬古霉素所致腎損傷具有保護(hù)作用進(jìn)行探討。筆者就此進(jìn)行了初步的研究，并對(duì)可能機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 工作液配制 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，本研究所涉及萬古霉素和姜黃素工作液濃度分別設(shè)定為30 μg/ml和25μmol/L。其中萬古霉素工作液的配制：將萬古霉素（美國(guó)Sigma公司）粉末用10ml 0.9%的生理鹽水溶解，配制成濃度為6 mg/ml的萬古霉素母液,再取1ml的萬古霉素母液,加入149ml的0.9%生理鹽水稀釋200倍配制成濃度為30 μg/ml的萬古霉素工作液。姜黃素工作液的配制：將姜黃素粉末(美國(guó)Sigma公司)25 mg溶于0.5 ml的二甲基亞砜（DMSO）中，待其完全溶解后加入無水乙醇至5 ml，配制成濃度為5 mg/ml的儲(chǔ)存液，再取276.30 μl的姜黃素母液，用滅菌三蒸水稀釋成150 ml的25 μmol/L姜黃素工作液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將健康的雄性SD大鼠（180～240g）麻醉后處死并于無菌操作下取其腎組織，去除包膜，分離并剪碎其腎皮質(zhì)，過篩網(wǎng)得腎小管節(jié)段，0.25%胰蛋白酶消化,離心獲得單個(gè)腎小管上皮細(xì)胞,在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)2~3 d，之后再用0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置相差顯微鏡下觀察并證實(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎小管上皮細(xì)胞,見圖1所示，將其按照4×105個(gè)/ml接種3 ml于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),當(dāng)達(dá)到80%的融合后棄培養(yǎng)基,經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗2次,再用無血清DMEM培養(yǎng)基同步靜止24 h后分別給予空白對(duì)照、姜黃素+萬古霉素、姜黃素和萬古霉素4種含不同藥物的工作液組，設(shè)定為空白對(duì)照組、姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組、姜黃素試驗(yàn)組和萬古霉素試驗(yàn)組，各組均含3瓶細(xì)胞。

1.3 乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）釋放百分率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)4h后的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到另一96孔板，每孔加入20 μl的細(xì)胞裂解液，經(jīng)37℃裂解45min后再各孔均加入180 μl的磷酸鹽緩沖液，充分混勻。將上清液與裂解液均3500 r/min 離心 10min， 每孔均取 50 μl樣品與 50 μl的LDH底物混合,室溫避光孵育30 min后加入終止反應(yīng)液50 μl，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其490 nm處的吸光度（OD）值。LDH釋放百分率（%）=上清液LDH釋放量/（上清液LDH釋放量+裂解液LDH 釋放量）×100%[6]。

1.4 丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量測(cè)定 針對(duì)各組再設(shè)立不同的培養(yǎng)時(shí)間 （0 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h、48 h） 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的 MDA 含量進(jìn)行考察，嚴(yán)格按照MDA檢測(cè)試劑盒的說明書（南京建成科技有限公司）測(cè)定MDA含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 培養(yǎng)3d見大量腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)

2 結(jié)果

2.1 LDH釋放百分率變化 細(xì)胞培養(yǎng)基中，LDH釋放百分率為萬古霉素試驗(yàn)組>姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組>姜黃素試驗(yàn)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與空白對(duì)照組相比，萬古霉素試驗(yàn)組和姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組的LDH釋放百分率均有增加（ΔLDH釋放百分率=試驗(yàn)組LDH釋放百分率+空白對(duì)照組LDH釋放百分率>0）,且萬古霉素試驗(yàn)組ΔLDH釋放百分率大于姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組ΔLDH釋放百分率，見表1。

2.2 MDA含量變化 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MDA含量在姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組和萬古霉素試驗(yàn)組中的含量均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增高,而姜黃素試驗(yàn)組和空白對(duì)照組中的MDA含量與0h相比無顯著變化（P>0.05），從24 h開始，在相同時(shí)間里，萬古霉素試驗(yàn)組中的MDA含量增高與姜黃素+萬古霉素試驗(yàn)組相比更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)基中各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的LDH釋放百分率及其變化（x±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA含量（μmol/L）變化比較（x±s，n=3）

3 討論

本研究采用腎小管上皮細(xì)胞對(duì)外源性物質(zhì)的腎臟毒性作用進(jìn)行研究,通?？赏ㄟ^測(cè)定腎小管上皮細(xì)胞胞內(nèi)酶LDH的釋放量并與空白對(duì)照組比較來反應(yīng)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度,其在細(xì)胞膜受損時(shí)可釋放到細(xì)胞外，當(dāng)ΔLDH釋放百分率（試驗(yàn)組LDH釋放百分率-空白對(duì)照組LDH釋放百分率）≤20%，表明存在細(xì)胞輕度損傷，當(dāng)ΔLDH釋放百分率為20~50%時(shí)則為細(xì)胞中度損傷，而當(dāng)ΔLDH釋放百分率≥50%時(shí),則表明存在細(xì)胞重度損傷[7]。本研究結(jié)果表明,萬古霉素對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞可能具有腎毒性,而姜黃素對(duì)萬古霉素所致腎損傷具有改善作用,由表1可知，25 μmol/L的姜黃素可減少約 49.10%（即（8.37~4.26/8.37）×100%）的萬古霉素所致腎小管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。

有關(guān)萬古霉素所致腎毒性的具體機(jī)制目前尚不十分明確，動(dòng)物研究表明，萬古霉素的腎毒性可能與其損害腎小球從而導(dǎo)致近端腎小管發(fā)生缺血壞死有關(guān),其機(jī)制主要是萬古霉素導(dǎo)致近曲小管上皮細(xì)胞活性氧自由基的大量產(chǎn)生并隨后發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所致[8,9]，另外有研究表明[10]，萬古霉素可導(dǎo)致近曲小管上皮細(xì)胞的氧耗量增加和線粒體功能改變以及腎組織中抗氧化酶（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）基因表達(dá)下降。MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,其含量多少可反映脂質(zhì)過氧化的程度[11]，本研究進(jìn)一步通過測(cè)定細(xì)胞MDA含量變化,對(duì)姜黃素改善萬古霉素所致腎損傷的可能機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果表明，隨著萬古霉素作用時(shí)間延長(zhǎng),大鼠腎小管上皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度越嚴(yán)重，而姜黃素可能具有抗氧化作用，其對(duì)該脂質(zhì)過氧化程度具有緩解作用,其機(jī)制可能與姜黃素能夠抑制脂過氧化反應(yīng)，維持過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性有關(guān)[12]。

綜上可知,本結(jié)果表明姜黃素對(duì)萬古霉素所致細(xì)胞腎損傷可能具有改善作用,并從氧化應(yīng)激反應(yīng)角度對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。但本研究尚存在一定局限性，首先，有研究表明，姜黃素雖可保護(hù)生物膜免受氧化應(yīng)激損傷,但高劑量的姜黃素有時(shí)卻表現(xiàn)為促氧化作用,使其效應(yīng)能從抗氧化促氧化之間相互轉(zhuǎn)換[13,14]，因此本研究尚未進(jìn)一步對(duì)不同劑量特別是高劑量姜黃素作用下,萬古霉素致腎小管上皮細(xì)胞的腎損傷程度變化進(jìn)行探討。此外，本研究尚未對(duì)調(diào)控氧化應(yīng)激上游的具體分子機(jī)制進(jìn)行探討，袁嫣等[15]的研究表明，急性鈾染毒誘導(dǎo)了大鼠腎組織的氧化應(yīng)激損傷并致急性腎毒性，而Nrf2通路損傷可能參與介導(dǎo)鈾誘導(dǎo)的大鼠急性腎毒性，因此，Nrf2通路損傷可能與萬古霉素所致腎毒性有關(guān)。而王道周等[16]的研究表明，姜黃素可能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，降低糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激、發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。因此，關(guān)于Nrf2信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激應(yīng)答能力降低是否與萬古霉素所致腎毒性具有相關(guān)性,且姜黃素對(duì)萬古霉素所致腎損傷的保護(hù)作用是否與其參與Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活作用有關(guān),尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。