急性胰腺炎患者血小板微粒水平變化及其對中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)形成的作用

祁琴琴， 楊 彬， 李會會， 鮑峻峻， 李鴻曄， 王兵兵， 梅 俏

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 合肥 230022

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)臨床上多表現(xiàn)為輕型[1]，但有20%～30%的AP患者可發(fā)展成重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) ，SAP病死率高達(dá)30%[2]。胰腺炎發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[3-4]，中性粒細(xì)胞激活胰蛋白酶引起胰腺組織損傷[5-6]，在AP發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[7]表明，血小板在中性粒細(xì)胞促進(jìn)胰腺損傷的過程中具有重要影響。血小板可以誘導(dǎo)胰腺內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-選擇素，促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化并介導(dǎo)血小板依賴的胰腺組織浸潤。同時(shí)，血小板通過表面表達(dá)的Toll樣受體(TLR)4，可結(jié)合中性粒細(xì)胞釋放中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)[8-9]，加重胰腺組織損傷。

胰腺炎患者發(fā)病過程存在血小板數(shù)量增加或減少的現(xiàn)象[10-11]，血小板活化脫顆粒，釋放活性物質(zhì)，加重胰腺炎癥損傷過程[12]。血小板活化過程中可形成大量血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)[13-14]，PMPs功能與活化的血小板相似，含有血小板膜組分及大量損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，如高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein, HMGB1)、P-選擇素和GPⅡb(CD41)等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和黏附，釋放蛋白水解酶及氧自由基等損傷胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞[15-16]。PMPs在急性心肌梗塞、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腎臟病等患者中水平均明顯升高[17-19]，表明PMPs與機(jī)體炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。但在胰腺炎過程中PMPs水平的改變尚不清楚。因此，本文通過檢測胰腺炎過程中PMPs水平的改變，以及PMPs刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力，探討PMPs參與AP病理生理過程的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年9月-2019年8月本院收治的AP患者55例，其中輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)26例，中重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)17例，重癥急性胰腺炎(SAP)12例，AP診斷標(biāo)準(zhǔn)參考亞特蘭大分類新標(biāo)準(zhǔn)共識[20]。另選取15例健康體檢查為對照組。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：PJ2018-12-17)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 PMPs分離 收集患者入院后(24 h內(nèi))次日晨血5 ml于檸檬酸鈉抗凝管中，以1000 r/min離心10 min獲取富血小板血漿，再將其以3500 r/min離心15 min，獲取貧血小板血漿(PPP)，-80 ℃保存。

1.3 PMPs檢測 將PPP冰上解凍，抽取50 μl PPP，加入5 μl CD61-PE充分混合孵育20 min，加入5 μl AnnexinV- FITC和400 μl Bindbuffer孵育20 min，再加入40 μl Flow-CountTM熒光計(jì)數(shù)微球充分混合，采用流式細(xì)胞儀檢測PMPs。使用5 μl兔抗人PE-IgG1及5 μl FITC-IgG1作為對照。CD61-PE 及 AnnexinV- FITC雙陽性為PMPs，根據(jù)熒光計(jì)數(shù)微球計(jì)算PMPs水平。

1.4 NETs形成能力的檢測

1.4.1 ELISA檢測髓過氧化物酶(MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白H3 留取健康體檢者晨血4 ml于EDTA抗凝管中，按照外周中性粒細(xì)胞分離試劑盒操作。在細(xì)胞培養(yǎng)板中置入圓形玻片，加入500 μl細(xì)胞懸浮液。分為兩組，一組加入250 μl AP患者的PMPs，另一組加入等量生理鹽水作為對照組。于37℃，5%CO2中培養(yǎng)6 h，滴管吸取上清液700 μl于EP管中， 1500 r/min離心5 min，再次取上清液。采用 ELISA方法檢測上清液中MPO、NE、組蛋白H3的水平。

1.4.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察NETs 取出上述細(xì)胞培養(yǎng)板底的圓形玻片，細(xì)胞面向下放置于載玻片，滴加多聚甲醛溶液(4% PFA)固定10 min，PBS洗滌3次， 0.05% Triton×300 μl室溫下破膜1min，用1%BSA封閉1 h。兔抗人CD61抗體(一抗)濕盒中4 ℃孵育過夜，PBS洗滌 5 次。加山羊抗兔IgG-H&L(二抗)37℃避光孵育 1 h，PBS緩沖液洗滌 5 次。再使用Alexa Fluor555標(biāo)記組蛋白H3和DAPI在室溫下避光孵育 15 min進(jìn)行免疫熒光染色，PBS 洗滌 3 次，封片，暗盒放置。激光共聚焦顯微鏡觀察NETs分布情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 MAP組男22例，女4例，年齡(42.58±14.31)歲；MSAP組男12例，女5例，年齡(50.88±17.97)歲；SAP組男8例，女4例，年齡(48.25±18.12)歲；對照組15例，男11例，女4例，年齡(47.21±16.54)歲，各組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。55例AP患者中膽源性17例，高脂血癥型21例，自身免疫型1例，混合型6例，其他10例。

2.2 AP患者中PMPs水平比較 與對照組相比[172.00(148.25～204.25)個(gè)/μl]，MAP、MSAP、SAP組PMPs水平明顯升高[179.50(145.00～308.750)個(gè)/μl、1117.50(483.00～2488.25)個(gè)/μl、1848.00(1216.50～2562.00)個(gè)/μl，H值分別為4.348、23.186、19.292，P值均<0.05]。與 MAP 組、 MSAP 組比較，SAP組PMPs水平明顯升高(H值分別為29.068、4.709，P值均<0.05)(圖1)。

2.3 AP患者中PMPs水平與臨床特征的相關(guān)性 AP患者的PMPs水平與APACHEⅡ評分、BISAP評分、Ranson評分均呈正相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r值分別0.636、0.508、0.430，P值均<0.001)。

注：a，對照組； b，MAP組； c，MSAP組； d，SAP組。

2.4 AP患者中PMPs促進(jìn)NETs形成能力的檢測 與對照組對比，AP組中MPO、NE和組蛋白H3水平均明顯增加(P值均<0.001)(表1)。

激光共聚焦顯微鏡觀察可見AP組中性粒細(xì)胞釋放NETs形成，對照組未發(fā)現(xiàn)明顯NETs形成(圖2)。

表1 AP組和對照組MPO、NE、組蛋白H3水平比較

3 討論

由于AP常伴發(fā)全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙，SAP病死率明顯升高。研究[21]表明，活化的血小板分泌多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞至靶器官，加重器官炎癥過程，因此，血小板活化在胰腺局部炎癥和遠(yuǎn)端器官衰竭中具有重要影響。Rahman等[22]研究表明血小板CD40L可介導(dǎo)膿毒癥引起中性粒細(xì)胞活化且募集于肺組織，引起肺水腫。Wetterholm等[23]發(fā)現(xiàn)在AP中血小板衍生的趨化因子CXCL4刺激中性粒細(xì)胞積聚，消耗血小板可以降低CXCL4水平，減少中性粒細(xì)胞募集、IL-6分泌和胰腺組織損傷。

注： a-b，AP組，圖a(×20)中可見中性粒細(xì)胞細(xì)胞破壞釋放NETs，如白色箭頭所示；圖b(×63，油鏡)中白色箭頭所指為NETs；c-d，對照組，未見NETs。

圖2激光共聚焦顯微鏡下AP組和對照組中NETs的形成

PMPs釋放是血小板活化過程的重要標(biāo)志[24]， PMPs具有與活化血小板相似的功能，含有血小板膜組分及大量DAMPs如HMGB1、P-選擇素和GPⅡb(CD41)等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集并黏附于靶器官[25]。PMPs增高與許多炎癥免疫性疾病相關(guān)。Boilard等[18]研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中 PMPs 增加，關(guān)節(jié)腔滑膜液中PMPs水平高于血清中 PMPs水平，但在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔滑膜液中未檢測到PMPs，提示血小板可能通過炎癥關(guān)節(jié)的血管進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，膠原活化血小板釋放 PMPs。Nadaud等[26]發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者中PMPs水平增多， PMPs促凝能力大于活化的血小板，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)AP患者中PMPs水平升高，且SAP組PMPs水平明顯高于MSAP、MAP組， PMPs與ARECHEⅡ、BISAP、Ranson評分呈正相關(guān)，表明PMPs參與AP進(jìn)展過程，可作為AP疾病嚴(yán)重程度評估的指標(biāo)。

研究[27]表明，胰腺組織局部可檢測出NETs的組分MPO、NE、組蛋白、DNA 等。Brinkmann等[28]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞胞外NETs是以 DNA為骨架，鑲嵌MPO、NE、組蛋白等蛋白質(zhì)。NETs參與清除外源性病原體，同時(shí)參與體內(nèi)無菌性炎癥過程如自身免疫性疾病等[29-31]。Merza等[32]發(fā)現(xiàn)通過?；悄懰猁}引起的的小鼠胰腺炎中，可檢測到胰腺組織中NETs形成。Bilyy等[33]發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重壞死的胰腺組織中， NE和瓜氨酸化組蛋白H3均陽性。Leppkes等[34]觀察到中性粒細(xì)胞可能在炎癥條件下進(jìn)入胰管并形成NETs，造成胰管內(nèi)阻塞，促進(jìn)AP發(fā)生。在急性肺損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，活化的血小板能夠刺激中性粒細(xì)胞釋放 NETs，抑制血小板活化可以減少 NETs 的釋放和組織損傷[35]。本研究發(fā)現(xiàn)來源于AP患者的PMPs，在體外與健康人中性粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后可觀察到NETs形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AP組中MPO、NE和組蛋白H3較對照組水平增高，可能在AP患者中導(dǎo)致胰管阻塞，進(jìn)一步加重胰腺炎癥過程。Murthy等[27]研究表明，AP患者血中NETs形成的標(biāo)志物與對照相比顯著升高，重癥AP較輕度AP升高明顯，與本研究結(jié)果相符。

綜上所述，AP中血小板活化生成PMPs，刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs阻塞胰管，加重AP嚴(yán)重程度，表明PMPs可作為AP疾病嚴(yán)重程度評估的指標(biāo)，降低 PMPs形成NETs能力可能有助于抑制胰腺的炎癥損傷過程。