清毒栓提取物通過調(diào)節(jié)Foxp3影響β-catenin通路從而抑制SiHa細(xì)胞活性的研究*

耿韋華 ，樓姣英 ，張 靜，王 瑩 ，李 美

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居全球女性惡性腫瘤第4位[1]，嚴(yán)重威脅女性身體健康和生命安全。人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的宮頸癌致病因素之一[2]，機(jī)體免疫力尤其是宮頸局部免疫微環(huán)境對(duì)于HPV感染的清除至關(guān)重要。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無能性，參與宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[3]。Foxp3是天然Treg最可靠的標(biāo)記物，是Treg發(fā)揮作用的決定因素[4]。有研究表明[5]，Treg細(xì)胞高表達(dá)Foxp3可以顯著抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。本課題組前期研究結(jié)果顯示，清毒栓可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞活性[6]，通過促進(jìn)相關(guān)免疫因子的表達(dá)來提高機(jī)體抗腫瘤能力[7]，但是否與Foxp3有關(guān)，具體通過何種途徑激活相關(guān)基因的表達(dá)，需要深入研究至分子信號(hào)通路方面。本研究以宮頸癌SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象，探討清毒栓提取物通過Foxp3調(diào)控β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞活性的機(jī)制，以期為臨床靶向治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌SiHa細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 清毒栓主要組成為紫草、莪術(shù)、黃柏等，均購(gòu)自北京同仁堂藥店，將復(fù)方藥物分別醇提（紫草）、油提（莪術(shù)）、水煎（黃柏），去渣濃縮后1劑藥濃縮至20 mL，終濃度約為4．2 g/mL，高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠22只，日齡49 d，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXX（鄂），2017-0012。分籠飼養(yǎng)，溫度24～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，通風(fēng)良好，每日光照12 h，晝夜交替。

1.4 主要試劑 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司）；pGEM-Foxp3重組質(zhì)粒（北京義翹神州科技有限公司）；脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000，Thermo Fisher公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF，南京沃宏公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad公司）；裂解液（碧云天公司）；Foxp3 抗體、G1/S-特異性周期蛋白-D1（cyclin D1）抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3） 抗體、c-Myc抗體、β-連環(huán)蛋白抗體（β-catenin antibody，1∶1 000，Affinity公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶2 500，Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）二抗（1∶4 000；Dianova，Hamburg，Germany公司）；ECL顯影液（Bio-Rad公司）；CCK8檢測(cè)試劑盒（七海生物公司）等。

1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；PCR擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；MultiskanMK3酶標(biāo)儀（MD公司）等。

2 方法

2.1 血清制備與提取 將22只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組和藥物組，每組各11只；分別用PBS和中藥對(duì)兩組小鼠進(jìn)行灌胃，早晚各1次，每次灌胃量為0．4 mL，連續(xù)灌胃3 d；兩組小鼠均于最后1次給藥后1～2 h摘眼球取血；將血液靜置30 min后，3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心10 min，取上清分裝到1 mL無菌EP管中，保存至-80℃冰箱備用。用前56℃水浴30 min，滅活補(bǔ)體。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。以pGEM-Foxp3為模板擴(kuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）得到目的片段后切膠回收，將目的片段連接pcDNA3．1載體，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆后，提取質(zhì)粒，利用LipofectamineTM2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)Foxp3的HPV感染陽性SiHa細(xì)胞，同時(shí)利用 pcDNA3．1空載體轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞株，作為本研究對(duì)照組，具體克隆及轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

2.3 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)分組 空白對(duì)照組：空白質(zhì)粒中加入空白血清，即0%含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)；Foxp3過表達(dá)組：Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒中加入空白血清進(jìn)行培養(yǎng)；空染血清組：空白質(zhì)粒中加入濃度為15%含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)；Foxp3過表達(dá)血清組：Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒中加入濃度為15%含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)。每組各3例。

2.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)Foxp3蛋白表達(dá)水平 分別用空白血清和15%含藥血清對(duì)Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒組及空白質(zhì)粒組進(jìn)行血清培養(yǎng)72 h，之后檢測(cè)4組SiHa細(xì)胞中Foxp3蛋白的相對(duì)表達(dá)量，具體步驟如下：1）蛋白提取及濃度測(cè)定：細(xì)胞用含有PMSF的裂解液裂解后測(cè)定濃度，將10 μg從細(xì)胞中獲得的細(xì)胞裂解液與5×樣品緩沖液混合后，將樣品上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠中。2）轉(zhuǎn)膜：SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。3）封閉：用含 0．1%聚山梨酯（Tween）的 4%牛奶進(jìn)行封閉。4）加入Fxop3antibody和GAPDHantibody抗體，4℃孵育過夜。5）洗膜：用含 0．1%Tween的PBS溶液將膜洗3遍。6）加入二抗：加入含0．1%Tween的4%牛奶以及HRP二抗在室溫條件下孵育1 h。7）顯影：在膜上滴加ECL顯影液并放入GelDoc成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進(jìn)行拍照。8）進(jìn)行圖像采集，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

2.5 CCK8法檢測(cè)SiHa細(xì)胞活性 細(xì)胞按照要求轉(zhuǎn)染處理后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、離心、細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105個(gè)/mL，接種于規(guī)格為96孔的培養(yǎng)板內(nèi)（150 μL/孔）；然后將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞貼壁變形后，在兩組Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒組及兩組空白質(zhì)粒組中以150 μL/孔分別加入含藥血清和空白血清，各組設(shè)5復(fù)孔。而后將培養(yǎng)板置入5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，于72 h后加入10 μL CCK8試劑，混勻，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度（A）值。

2.6 Western Blot法檢測(cè)Foxp3下游信號(hào)分子的表達(dá) 經(jīng)血清培養(yǎng)后，用WesternBlot法對(duì)4組細(xì)胞Foxp3下游信號(hào)分子 β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Caspase-3的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)方法同上。

2.7 數(shù)據(jù)處理 檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS 21．0軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Western Blot法檢測(cè)不同組別SiHa細(xì)胞中Foxp3蛋白水平 Foxp3過表達(dá)組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與空染血清組相比，SiHa細(xì)胞中Foxp3的相對(duì)表達(dá)量均增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；空染血清組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與Foxp3過表達(dá)組相比，F(xiàn)oxp3的相對(duì)表達(dá)量均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；Foxp3過表達(dá)血清組與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)oxp3 相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 1。

圖1 Western Blot法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Foxp3蛋白水平的條帶圖及灰度統(tǒng)計(jì)圖（±s，n=3）Fig.1 Histogramandgrayscalestatisticalmapofthelevelof Foxp3 in SiHa cells detected by Western Blot（±s，n=3）

3.2 CCK8法檢測(cè)SiHa細(xì)胞活性 結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3過表達(dá)組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與空染血清組相比，F(xiàn)oxp3過表達(dá)質(zhì)粒組的A 值均增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；空染血清組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與Foxp3過表達(dá)組相比，含藥血清組的A值較相應(yīng)的對(duì)照組均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；Foxp3過表達(dá)血清組與空白對(duì)照組相比，A值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 2。

圖 2 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活性（±s，n=3）Fig.2 Cell activity detected by CCK8（±s，n=3）

3.3 Western Blot法檢測(cè)Foxp3下游信號(hào)分子的表達(dá) Foxp3過表達(dá)組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與空染血清組相比，β-catenin、c-Myc、cyclinD1 的蛋白表達(dá)量均增加（P＜0．01）而 Caspase-3的蛋白表達(dá)量均降低（P＜0．05 或 P＜0．01）；空染血清組與空白對(duì)照組相比、Foxp3過表達(dá)血清組與Foxp3 過表達(dá)組相比，β-catenin、c-Myc、cyclinD1相對(duì)表達(dá)量均下降而Caspase-3的蛋白表達(dá)量均增高（P＜0．01）。見圖 3。

圖3 Western Blot法檢測(cè)Foxp3下游信號(hào)分子的表達(dá)（±s，n=3）Fig.3 Expression of Foxp3 downstream signal molecule detected by Western Blot（±s，n=3）

4 討論

Foxp3是調(diào)控Treg細(xì)胞發(fā)育功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子[8-9]。有研究證實(shí)[10-11]，F(xiàn)oxp3突變可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)受損，并促進(jìn)自身免疫疾病發(fā)展，減弱對(duì)某些腫瘤和感染的免疫。Huang等[12]發(fā)現(xiàn)Foxp3在宮頸癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，約為91．56%，且Foxp3表達(dá)水平與腫瘤大小及FIGO分期明顯相關(guān)，因此Foxp3可能是預(yù)測(cè)宮頸癌患者治療效果的有用生物標(biāo)志物。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致β-catenin不被降解，在核內(nèi)堆積，促進(jìn)下游靶基因，如c-Myc和cyclinD1等的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞增殖/分化失控，使細(xì)胞過度增殖惡化[13-14]。c-Myc和cyclinD1作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期規(guī)則表達(dá)中發(fā)揮重要作用。Caspase-3則是經(jīng)典凋亡中的一種重要蛋白，由內(nèi)源性（線粒體）和外源性（死亡配體）凋亡通路激活，參與經(jīng)典的卵裂后凋亡通路，他們均與惡性腫瘤的抑制密切相關(guān)[15-16]。

金哲教授以“攻毒散結(jié)”為法，研制出中藥清毒栓，在治療HPV感染引起的宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變等方面取得了較為滿意的臨床效果[17]。前期課題研究發(fā)現(xiàn)清毒栓可能是通過阻斷細(xì)胞從G0～G1期向S期分化及促進(jìn)其凋亡而達(dá)到抑制腫瘤的作用[6]，也可能抑制Treg對(duì)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）中相關(guān)蛋白的上調(diào)來改變局部免疫微環(huán)境而達(dá)到抑制腫瘤的作用[18]。Foxp3作為Treg重要的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持其功能起重要作用，清毒栓的抗腫瘤作用機(jī)制是否與其有關(guān)，有待研究。Ghasemi等[19]研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，清毒栓是否通過該通路起作用，也有待證實(shí)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同組別SiHa細(xì)胞中Foxp3蛋白水平及其細(xì)胞活性，并對(duì)Foxp3下游信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè)，目的是研究Foxp3在SiHa細(xì)胞中的影響以及在清毒栓誘導(dǎo)的SiHa活性下調(diào)中的角色，進(jìn)一步闡明清毒栓的作用機(jī)制與Treg細(xì)胞及Foxp3的關(guān)系，從而為中藥預(yù)防HPV相關(guān)宮頸癌的發(fā)生提供更加充足的理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)采用Western Blot法檢測(cè)分別經(jīng)空白血清及15%含藥血清處理的過表達(dá)質(zhì)粒組及空載質(zhì)粒組的Foxp3及其下游信號(hào)分子β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Caspase-3的表達(dá)，并用CCK8法檢測(cè)4組細(xì)胞的活性。過表達(dá)質(zhì)粒組與相應(yīng)的空白質(zhì)粒組相比，F(xiàn)oxp3的表達(dá)量均增高，SiHa細(xì)胞的活性均增高，說明已成功建立穩(wěn)定的Foxp3過表達(dá)SiHa細(xì)胞株，且Foxp3過表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖。含藥血清處理的組別較相應(yīng)的對(duì)照組Foxp3的表達(dá)量和SiHa細(xì)胞的活性均降低，說明清毒栓含藥血清可抑制SiHa細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)并可抑制SiHa細(xì)胞活性。15%含藥血清處理的Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒組與空白血清處理的空白質(zhì)粒組兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明通過過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)含藥血清導(dǎo)致的Foxp3表達(dá)下調(diào)，可改變含藥血清的藥效，從而說明含藥血清通過Foxp3起到調(diào)節(jié)作用。對(duì)Foxp3下游信號(hào)分子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3可以顯著增加βcatenin、c-Myc、cyclinD1 含量并抑制 Caspase-3 剪切，且可以抑制含藥血清誘導(dǎo)的β-catenin、c-Myc、cyclinD1含量下調(diào)以及Caspase-3剪切增加，說明清毒栓含藥血清是通過調(diào)節(jié)Foxp3影響β-catenin通路而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。

綜上所述，F(xiàn)oxp3可通過激活β-catenin通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡來增加SiHa細(xì)胞活性，在SiHa細(xì)胞中扮演著原癌基因角色，而清毒栓含藥血清可能通過調(diào)節(jié)Foxp3影響β-catenin通路從而抑制SiHa細(xì)胞活性。本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了清毒栓提取物通過調(diào)節(jié)Foxp3抑制SiHa細(xì)胞活性的機(jī)制，為日后研發(fā)有效的抗腫瘤中藥提供一定的思路及理論依據(jù)，但β-catenin、cyclinD1和c-Myc不能完全解釋細(xì)胞周期調(diào)控的精確機(jī)制，進(jìn)一步研究細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制可能會(huì)給宮頸癌的治療帶來突破性進(jìn)展。