從PI3K/Akt和MAPK/Erk信號通路探討復(fù)方當(dāng)歸注射液對擬缺血神經(jīng)元的作用*

李韻歆 ，湯軼波 ，鄭燕飛，李 月 ，于 雪 ，張巧慧，陳亞飛 ，白 雪 ，馬 茹，劉振權(quán)

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

腦血管疾病是中老年人的常見病之一，占死因構(gòu)成率20%以上，為中國三大高病死率疾病[1]。腦血管疾病以中風(fēng)為主，其中缺血性中風(fēng)占中風(fēng)患者總發(fā)病數(shù)量的70%，且發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[2]，在臨床上急性治療以及后續(xù)患者恢復(fù)均是醫(yī)學(xué)一大難題。缺血性中風(fēng)病理機(jī)制復(fù)雜，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）各組織、細(xì)胞均發(fā)生一系列復(fù)雜的缺血損傷反應(yīng)，至今尚未完全研究徹底，神經(jīng)血管單元的提出為缺血性中風(fēng)治療機(jī)制研究提供了新靶點(diǎn)，它讓中風(fēng)的研究不僅僅著眼于單一的某細(xì)胞，而更全面地考慮到在生理、病理的條件下，細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與胞外環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用，更注重整體觀[3]。大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）是組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線血腦屏障（BBB）的關(guān)鍵細(xì)胞。在神經(jīng)血管單元整體微環(huán)境中，內(nèi)皮細(xì)胞通過其緊密連接及潛在的分泌功能，精密調(diào)節(jié)著腦部微環(huán)境[4]。當(dāng)藥物入血以后進(jìn)入CNS，首先接觸到的就是內(nèi)皮細(xì)胞，故從細(xì)胞層面研究藥物對缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制時(shí)，除觀測神經(jīng)元外，更不能忽略內(nèi)皮細(xì)胞的存在。

中藥活血通絡(luò)方藥常對中風(fēng)具有較好的療效[5]，課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由當(dāng)歸、川芎、紅花3味活血中藥組成的復(fù)方當(dāng)歸注射液（CAI）對大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型大鼠具有保護(hù)作用[6]。它在后續(xù)的離體實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CAI可明顯抑制BMECs因擬缺血損傷引起的炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量增加，顯著下調(diào)丙二醛（MDA）含量，具有抗炎、抗氧化的作用[7]?，F(xiàn)已有研究證實(shí)擬缺血內(nèi)皮細(xì)胞條件液對可降低正常神經(jīng)元活性，并能進(jìn)一步加重已受損神經(jīng)元[8]，可見內(nèi)皮的狀態(tài)會影響神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)在考慮內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)元之間聯(lián)系的基礎(chǔ)上用BMECs條件液作用于神經(jīng)元，這樣更接近于離體的共培養(yǎng)體系并符合實(shí)際情況，并用氧糖剝奪法（OGD）模擬缺血性中風(fēng)發(fā)生時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元缺血性損傷的多種生理病理過程，制備BMECs及神經(jīng)元擬缺血損傷離體模型，從磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Erk）信號通路為切入點(diǎn)，探究CAI通過BMECs干預(yù)神經(jīng)元擬缺血損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠7 d齡6只，體質(zhì)量（20±5）g；SPF級雄性SD乳鼠1 d齡10只，均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 藥品與試劑 CAI購于福建古田藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：1710102；胎牛血清、DMEM/F-12 培養(yǎng)基干粉、雙抗購于美國Gibco公司；明膠、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、膠原酶購于美國Sigma公司；氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鎂（MgCl2）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰島素注射液購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：4349503；肝素注射液購自常州千紅生化制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：1516110294；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS）購自北京中科邁晨科技有限公司；L-多聚賴氨酸購于北京博奧拓達(dá)公司；NEUROBASAL、B-27、GLUTAMAX均購于美國invitrogen公司；CD31相關(guān)抗體購于英國Abcam公司；CCK8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、一抗稀釋液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、通用顯影液、酸性定影液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；磷酸酶抑制劑混合物購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；脫脂奶粉購于美國BD公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）購于美國AMERSCO公司；10×TBST、10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、膜再生液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液購于中國solaibio公司；ECL發(fā)光液、PVDF膜購于美國millipore公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）熒光標(biāo)記抗兔IgG、兔GAPDH單克隆抗體購于proteintech公司；兔抗大鼠Akt（C67E7）、磷酸化Akt（p-Akt）（Ser473）、Erk1/2（137F5）、磷酸化Erk（p-Erk）（Thr202/Tyr204）抗體購于美國CST公司；FITC熒光標(biāo)記抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取7 d齡雄性SD大鼠，冰上斷頭處死，置于預(yù)冷的75%乙醇浸泡3～5 min，無菌條件下沿大鼠腦正中線剪開顱骨，剔除硬腦膜，取出兩側(cè)大腦半球，用預(yù)冷的D-Hank’s液（NaCl8g，KCl0．4g，KH2PO40．06g，NaHCO30．35g，Na2HPO4·12H2O 0．134 g/1 000 mL蒸餾水）漂洗2次，在含有胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞沖洗液中仔細(xì)剔除軟腦膜、大血管以及大腦髓質(zhì)部分，收集大腦皮質(zhì)，剪碎至1 mm3后勻漿。然后依次通過200 μm和76 μm濾網(wǎng)過濾，收集76μm濾網(wǎng)上的微血管段，1000r/min，離心半徑 15．8 cm，離心 5min。棄上清，加入 0．2%Ⅱ型膠原酶溶液37℃消化20 min，1 000 r/min，離心半徑15．8 cm，離心5 min。將下層沉淀用內(nèi)皮細(xì)胞沖洗液漂洗離心2次。所得沉淀用配制的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，接種于明膠覆蓋的25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%的 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d 后第1次換液，7～8 d細(xì)胞生長成致密單層，出現(xiàn)“鋪路石”征象后可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫熒光鑒定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 將原培養(yǎng)液延邊緣輕柔吸去，加入預(yù)熱至37℃的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次，5 min/次；4%的多聚甲醛室溫固定20 min；吸去多聚甲醛固定液，PBS洗3遍，10 min/次；加入 0．2%的 Triton X100 透化 5 min；PBS洗3遍，5 min/次；37℃5%山羊血清封閉45 min；去除封閉液，滴加CD31相關(guān)抗原（1∶100）濕盒內(nèi)4℃2 h；復(fù)溫 1 h 后，用 PBS 沖洗 3 次，加入二抗（1∶400），4℃過夜孵育；PBS洗3遍，5 min/次；加入DAPI避光孵育 5～10 min；PBS 洗 3 遍，5 min/次；熒光顯微鏡取隨機(jī)視野觀察并拍照。

1.5 BMECs擬缺血損傷模型與條件培養(yǎng)液的制備 將第 3 代 BMECs調(diào)整細(xì)胞密度為 5×104～1×105/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)器中，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞出現(xiàn)“鋪路石”征象后，分為5組：正常組、模型組、藥物低、中、高劑量組（濃度分別為 1．25、2．5、5 μL/mL CAI）。正常組、模型組不行任何處理；CAI低、中、高劑量組分別給予含各濃度CAI的內(nèi)皮完全培養(yǎng)液并放置在37℃含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。經(jīng)過12 h藥物處理后，將各組原培養(yǎng)液吸出，用DHank’s溶液輕輕洗滌2遍，正常組換完全培養(yǎng)液，模型組與給藥組給予無糖kreb’s溶液及含不同濃度 CAI的 kreb’s溶液，并在含 1%O2、5%CO2、94%N2的恒溫三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。造模結(jié)束后收集各組條件培養(yǎng)液：正常條件培養(yǎng)液（N-CM）、模型條件培養(yǎng)液（I-CM）、CAI低、中、高劑量干預(yù)后條件培養(yǎng)液（IC-CML、IC-CMM、IC-CMH）。

1.6 大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 將出生24 h內(nèi)的新生鼠于-20℃預(yù)凍20 min左右取出，浸泡于75%4℃預(yù)冷的乙醇中，浸泡消毒。無菌條件下，先沿后囟門剪開皮膚，再沿大鼠腦正中線剪開顱骨，小心剝除硬腦膜和血管，取出兩側(cè)大腦半球放于D-Hank’s液的玻璃平皿中沖洗。隨后在冰盤上用眼科彎鑷剝離大血管及大腦髓質(zhì)，最終收集大腦皮質(zhì)于裝有D-Hank’s液的小燒杯中，用眼科剪剪成大小約1 mm3的小塊后，移入15 mL的離心管。用濃度為0．125%胰酶，37℃恒溫箱消化20 min。用含10%胎牛血清的維持液終止消化后棄上清。加入神經(jīng)元接種液重懸，用吸管輕輕反復(fù)吹打成均勻的細(xì)胞懸液。用74 μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于已用L-多聚賴氨酸包被的孔板中純化培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液更換為無血清的神經(jīng)元維持培養(yǎng)液（97%NEUROBASAL+2%B-27+l%GLUTAMAX），以后每2～3 d半量換液，實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)7～9 d左右的細(xì)胞。

1.7 免疫熒光鑒定神經(jīng)元 熒光鑒定操作方法同內(nèi)皮細(xì)胞，采用NSE多克隆抗體（1∶200）濕盒內(nèi)常溫2 h孵育。

1.8 神經(jīng)元分組、BMECs條件液干預(yù)并建立擬缺血損傷模型 將原培養(yǎng)液吸出，用D-Hank’s溶液輕輕洗滌2遍后分為N-CM處理組、I-CM處理組及給各IC-CM處理組。N-CM作用于正常神經(jīng)元（在原培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h）；I-CM、IC-CML、IC-CMM、IC-CMH作用于各組擬缺血損傷神經(jīng)元（在含1%O2、5%CO2、94%N2的恒溫三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h）。

1.9 觀察指標(biāo)

1.9.1 神經(jīng)元存活率測定 采用CCK8方法檢測：吸棄96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞上清液，每孔加入NEURALBASAL 100 μL，CCK8 溶液 10 μL，置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（選擇λ=450 nm波長）測定各孔吸光度（A）值。

1.9.2 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測PI3K、MAPK 信號通路磷酸化水平（p-Akt、Akt、p-Erk、Erk） 造模后收集各組細(xì)胞并裂解提取蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入一抗，4℃過夜。次日以TBST洗膜后再加入HRP標(biāo)記的二抗，置室溫1 h，ECL顯色。以GAPDH作內(nèi)參對照，Image J分析灰度值進(jìn)行計(jì)算灰度系數(shù)比。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 9．2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和GraphPad Prism8作圖，計(jì)量資料釆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，各組數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，組間比較釆用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMECs第3代形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 如圖1所示，培養(yǎng)至第3代BMECs形態(tài)呈長梭型（1a，200×），通過免疫熒光染色檢測，其中綠色熒光代表CD31 陽性細(xì)胞（1b，400×），藍(lán)色熒光代表 DAPI染色的細(xì)胞核（1c，400×），綠、藍(lán)色重合代表 CD31 陽性內(nèi)皮細(xì)胞（1d，400×），培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞純度達(dá)95%以上，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)過程中形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 在倒置顯微鏡下觀察，見圖2，接種后的皮層神經(jīng)元24 h（圖2a，400×）后基本全部貼壁，形態(tài)呈圓形或卵圓形，細(xì)胞數(shù)量多，體積?。唤臃N后3d（圖2b，400×）的細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞有突起長出；培養(yǎng)至 5 d（圖 2c，400×），神經(jīng)元胞體變大，相互交織成網(wǎng)，基本鋪滿視野；培養(yǎng)至 7 d（圖 2d，400×），視野下神經(jīng)元形態(tài)清晰，胞體透亮。

如圖3所示，培養(yǎng)至7～9 d NSE鑒定，其中綠色熒光代表NSE陽性細(xì)胞（圖3a，400×），藍(lán)色熒光代表 DAPI染色的細(xì)胞核（圖 3b，400×），藍(lán)、綠色重合代表NSE陽性神經(jīng)元（圖3c，400×），免疫熒光顯示其純度達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 大鼠BMECs形態(tài)及熒光鑒定Fig.1 Morphology and fluorescence identification of rats’brain microvascular endothelial cells

圖2 大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Morphology of rats’cortical neurons

2.3 神經(jīng)元活性 如表1所示，I-CM處理后OGD造模神經(jīng)元活性較N-CM處理組顯著降低（P＜0．01）。所有劑量IC-CM處理的OGD造模神經(jīng)元活性均高于 I-CM 處理組（P＜0．05 或（P＜0．01），其中 IC-CMM、IC-CMH 處理組神經(jīng)元活性升高顯著（P＜0．01）。

2.4 PI3K信號通路相關(guān)蛋白Akt、Akt磷酸化水平 經(jīng)統(tǒng)計(jì)各組Akt組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；I-CM處理組神經(jīng)元p-Akt/Akt較N-CM處理組顯著降低（P＜0．01），相對于 I-CM 處理組，各 IC-CM處理組神經(jīng)元p-Akt/Akt均顯著升高（P＜0．05或P＜0．01），并呈現(xiàn)一定劑量依賴性升高趨勢。見圖4、5。2.5 MAPK信號通路相關(guān)蛋白Erk、Erk磷酸化水平 如下所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)各組Erk組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；I-CM 處理組神經(jīng)元 p-Erk/Erk 較N-CM 處理組顯著升高（P＜0．01），但相對于 I-CM 處理組，各IC-CM處理組神經(jīng)元p-Erk/Erk差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但從均值比較可看出 IC-CM 各處理組較I-CM處理組有所降低，并且在IC-CMM處理組最低。見圖6、7。

3 討論

神經(jīng)元之間的電化學(xué)信號調(diào)節(jié)大腦的認(rèn)知、新陳代謝和肢體協(xié)調(diào)等多方面，早期研究報(bào)道，腦缺血梗死灶中心的大多數(shù)凋亡細(xì)胞被鑒定為神經(jīng)元[9]，因此靶向治療并防止神經(jīng)元凋亡是挽救缺血性中風(fēng)后腦梗死面積的有效途徑?，F(xiàn)階段在對缺血性中風(fēng)的機(jī)制研究中對于神經(jīng)元研究的角度豐富，用OGD法造擬缺血損傷模型能很好模擬大腦實(shí)質(zhì)中O2和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)中斷：Chen等[10]發(fā)現(xiàn)用白細(xì)胞介素-10（IL-10）處理培養(yǎng)的神經(jīng)元OGD損傷后9～24 h，可獲得最佳的抗凋亡作用。Lin等[11]確定IL-10在20 ng/mL劑量時(shí)保護(hù)作用最好。Gaidin等[12]使神經(jīng)元中的選擇性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）過表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元免受OGD和谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性。Zhang等[13]用miR-7a-2-3p能明顯減少OGD神經(jīng)元凋亡，考慮與波形蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)。

另外維持大腦精確且平衡的微環(huán)境離不開BBB的作用，BBB能調(diào)節(jié)血液和腦腔之間的物質(zhì)交換，控制大腦所需的離子、O2和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入，限制毒素和病原體的入侵保護(hù)CNS[14]。為了維持這種強(qiáng)大的屏障，BMECs通過高電壓緊密連接（TJ）和相鄰細(xì)胞的細(xì)胞骨架黏附連接形成血漿與腦之間的滲透屏障，保證了BBB的功能[15]。BMECs在生理病理狀態(tài)下與神經(jīng)元關(guān)系密切，可分泌BDNF幫助神經(jīng)元遷移與分化[16]及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)新生[17-19]。BMECs損傷后導(dǎo)致其分泌功能紊亂還會進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[20]。鑒于內(nèi)皮細(xì)胞不容忽視的作用，實(shí)驗(yàn)以內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液來探討藥物對神經(jīng)元的干預(yù)，兼顧考慮了內(nèi)皮細(xì)胞的分泌作用，內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用，也更注重了整體性。

此次實(shí)驗(yàn)所用的CAI具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛的作用，其中所含的川芎、當(dāng)歸和紅花近年來被廣泛應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究，當(dāng)歸、川芎中的有效成分多糖及揮發(fā)油以及紅花中的黃酮類對腦損傷均有保護(hù)作用[21-25]。在1977年便曾有過首次用CAI嘗試治療腦動(dòng)脈硬化，也取得了一定的療效[26]。在夾脊穴穴位注射治療短暫性腦缺血發(fā)作患者中發(fā)現(xiàn)能降低血管內(nèi)阻力，增加腦灌注，從而改善腦缺血及缺氧狀態(tài)[27]。諸多的離體與在體實(shí)驗(yàn)也均證實(shí)了CAI對心腦血管疾病具有防治作用[28]。

圖3 神經(jīng)元熒光鑒定Fig.3 Neuron fluorescence identification

表1 各組神經(jīng)元A值比較（±s）Tab.1 Comparison of neuron A values of each group（±s）

表1 各組神經(jīng)元A值比較（±s）Tab.1 Comparison of neuron A values of each group（±s）

注：與N-CM處理組比較，*P＜0．01；與I-CM處理組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 n N-C M處理組 4 I-C M處理組 4 I C-C M L處理組 4 I C-C M M處理組 4 I C-C M H處理組 4 A值1．9 0±0．0 6 0．9 3±0．0 4*1．0 9±0．0 1#1．2 4±0．0 2##1．2 7±0．0 6##

圖4 各組神經(jīng)元Akt和p-Akt的表達(dá)Fig.4 Akt and p-Akt expression of neuron of each group

圖5 各組神經(jīng)元p-Akt/Akt比較（±s,n=4）Fig.5 Comparison p-Akt/Akt of neuron of each group（±s,n=4）

圖6 各組神經(jīng)元Erk和p-Erk的表達(dá)Fig.6 Erk and p-Erk expression of neuron of each group

圖7 各組神經(jīng)元p-Erk/Erk比較（±s,n=4）Fig.7 Comparison p-Erk/Erk of neuron of each group（±s,n=4）

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過CCK8活性檢測可知道CAI干預(yù)后的內(nèi)皮條件培養(yǎng)液對擬缺血神經(jīng)元具有直接的保護(hù)作用。IC-CM處理組神經(jīng)元的p-Akt/Akt較I-CM處理組明顯升高；并且，對比I-CM處理組p-Erk/Erk明顯升高，IC-CM各處理組p-Erk/Erk與I-CM處理組相比有所降低，但無明顯的差異。PI3K/Akt和MAPK/Erk在腦缺血研究中是兩條經(jīng)典的信號通路，他們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能：細(xì)胞生長、分裂、增殖、分化、凋亡和自噬。

大量研究證實(shí)PI3K/Akt信號通路對于神經(jīng)元經(jīng)歷腦缺血損傷后的存活和抗凋亡至關(guān)重要：Jin等[29]通過康復(fù)訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt信號通路從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可促進(jìn)缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；Fan等[30]發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)元凋亡是S-奧拉西坦減輕缺血性卒中的重要機(jī)制之一；內(nèi)源性大麻素通過包括PI3K/Akt在內(nèi)的多種信號通路在預(yù)防缺血性中風(fēng)和缺血耐受中發(fā)揮了重要作用[31]。當(dāng)PI3K信號通路激活后，Akt的Thr308和Ser473位點(diǎn)被磷酸化，進(jìn)而激活多種凋亡途徑相關(guān)蛋白[32]，例如：p-Akt使B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）相關(guān)死亡促進(jìn)因子（Bad）磷酸化，從而無法與使抗凋亡蛋白Bcl-2和B淋巴細(xì)胞瘤-XL（Bcl-XL）二聚化并使其失活來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32-33]、作用于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-9使之滅活從而無法激活凋亡蛋白酶Caspase-3[34]、磷酸化P53從而增加P53的降解而增加細(xì)胞存活[35]，使叉頭蛋白O1（FKHR）磷酸化并分布于細(xì)胞質(zhì)，從而阻止其在細(xì)胞核中的凋亡進(jìn)程[32，36]等。

與PI3K途徑不同，Erk介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于神經(jīng)元存活的作用存在爭議。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶Erk是絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族的主要成員之一，包括Erk1和Erk2，統(tǒng)稱為Erk1/2[37]，現(xiàn)有的研究顯示磷酸化Erk在缺血性中風(fēng)中扮演著重要角色：缺血前3周的跑步機(jī)訓(xùn)練可以下調(diào)缺血誘導(dǎo)的磷酸化Erk1/2的增加并有效保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[38]；抑制中風(fēng)急性期Erk1/2激活可減少中風(fēng)后2 d的梗塞面積和神經(jīng)功能缺損[39]；大腦中動(dòng)脈阻塞7 d的大鼠p-Erk1/2有所降低[40]。這種在體實(shí)驗(yàn)的雙向結(jié)果也體現(xiàn)在許多探討Erk與缺氧神經(jīng)元的關(guān)系中：Zhao等[41]研究發(fā)現(xiàn)缺氧6 h大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞p-Erk下降；Jeong等[42]將神經(jīng)元缺氧6、15 h后p-Erk上升；王瑞等[43]缺氧培養(yǎng)神經(jīng)元2 h后發(fā)現(xiàn)p-Erk下降；司瑋[44]缺氧1 h培養(yǎng)神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)p-Erk上升。有考慮一是缺氧缺血在持續(xù)時(shí)間與程度存在差異，二是中度Erk磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)，而持續(xù)的、廣泛的Erk磷酸化可能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[45]，如持續(xù)活化會增加神經(jīng)元細(xì)胞的谷氨酸毒性[38]；若激活c-Jun氨基末端激酶（JNK），則繼發(fā)磷酸化激活包括細(xì)胞應(yīng)激和腫瘤壞死因子在內(nèi)的多種凋亡因子而使興奮性毒性神經(jīng)元凋亡[46]；磷酸化p38又可起到抗凋亡作用[47]；還可同p-Akt一樣使Bad磷酸化，兩條通路之間有共同活化靶點(diǎn)[31]。

本實(shí)驗(yàn)在考慮在體實(shí)際內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)元關(guān)系密切的基礎(chǔ)上，在細(xì)胞水平上通過OGD法對BMECs和神經(jīng)元造成擬缺血損傷，探究CAI對缺血性腦損傷離體模型的影響。結(jié)果證實(shí)CAI可通過干預(yù)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而干預(yù)擬缺血損傷神經(jīng)元，改善神經(jīng)元存活，且該保護(hù)作用可能與活化PI3K/Akt信號通路從而抑制神經(jīng)元凋亡有一定相關(guān)性，考慮存在上述PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)的多條保護(hù)途徑；與MAPK/Erk信號通路的關(guān)聯(lián)不大，但考慮有神經(jīng)元缺血缺氧程度因素，此結(jié)論限定在此造模條件下，不可一概而論。后續(xù)可研究通路下游蛋白、多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行猜想驗(yàn)證。