補腎健脾活血法對重型再生障礙性貧血免疫抑制治療后早期造血恢復的影響*

談栩鋮，趙 琳，趙藝涵，邱仲川，瞿瑋穎，朱小勤，張文君，陸 泳

（1．上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院血液科，上海 200021；2．同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200092）

再生障礙性貧血（AA）是一種免疫介導的以全血細胞減少為特征的骨髓衰竭性疾病。重型再生障礙性貧血（SAA）屬于AA中較為嚴重的一型，其血細胞重度減少，發(fā)展迅速，預后不佳。免疫抑制治療（IST）是目前SAA的一線治療之一，應用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）聯(lián)合環(huán)抱素A（CsA）治療SAA反應率為60%～80%[1]，患者獲得IST反應的中位時間多數(shù)在治療后的2～3個月，20%的患者則在3～6個月后出現(xiàn)[2]。IST的運用使SAA病死率從95%下降到10%～20%[3]，但仍有相當一部分患者由于骨髓造血早期未能恢復，造成感染、出血風險增加，乃至死亡[4]。SAA為臨床常見的難治性血液系統(tǒng)疾病，中西醫(yī)結合治療該病的效果已得到認可，如何在IST中聯(lián)合中醫(yī)藥進行有效干預以提高SAA療效值得重視。本研究采用隨機雙盲對照試驗，驗證免疫抑制劑聯(lián)合“補腎健脾活血”法治療SAA療效的可靠性，觀察其對T淋巴細胞亞群的影響，探討其在SAA早期造血恢復中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月—2017年12月在上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院血液科就診的SAA患者60例。采用中央隨機系統(tǒng)進行隨機化過程，通過網(wǎng)絡申請得到隨機號，隨機化程序設計采用SAS 9．3進行，將入組患者分為治療組和對照組各30例。治療組男16例，女14例；年齡15～70歲，平均（44．88±13．74）歲；病程最短 1 個月，最長 5 年，平均（0．92±0．78）年。對照組男 13 例，女 17 例；年齡16～73 歲，平均（42．57±16．32）歲；病程最短 3 個月，最長 6 年，平均（0．89±0．71）年。兩組患者性別、年齡、病程、血象、骨髓象方面比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（2015-KL-002-02）。

1.2 診斷與納入標準 符合《血液病診斷及療效標準》SAA診斷標準[5]，疾病處于造血恢復早期階段抗胸腺細胞球蛋白（ATG）聯(lián)合CsA治療1個月內，并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 1）排除其他引起全血細胞減少的疾病，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、骨髓增生異常綜合征、急性造血功能停滯、骨髓纖維化等。2）排除先天性AA患者。3）SAA考慮進行造血干細胞移植治療的AA患者。4）合并嚴重心、腦、肝、腎疾病及精神病患者，ECOG評分＞2分。5）妊娠、哺乳期婦女。6）無法服用中藥或對中藥過敏的患者。

1.4 治療方法 兩組均予IST。兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（Genzyme Polyclonals S．A．S 生產；批號：T03D-2）2．5 mg/（kg·d），加入生理鹽水250 mL中靜脈滴注4～6 h，連用5 d。環(huán)孢素軟膠囊（杭州中美華東制藥有限公司；批號：120932），口服劑量5 mg/（kg·d），每日2次，定期監(jiān)測患者血藥濃度，使環(huán)孢素濃度維持在150～250 ng/mL。

兩組均予支持治療：如血紅蛋白＜60 g/L，予紅細胞懸液輸注；如血小板計數(shù)＜5．0×109/L（無出血危險因子）或＜20．0×109/L（有明顯出血傾向或存在出血危險因子），予血小板懸液輸注及對癥止血治療。如合并感染，根據(jù)感染部位及嚴重程度及時給予有效抗感染治療。

治療組在西醫(yī)綜合治療方案基礎上聯(lián)合運用中藥補腎健脾活血方，藥物組成：熟地黃20 g，山茱萸 20 g，淮山藥 20 g，牡丹皮 15 g，茯苓 20 g，鹿角膠（烊化）12 g，仙茅 10 g，仙靈脾 10 g，炙黃芪 30 g，黨參 20 g，白術 20 g，生龍骨 30 g，生牡蠣 30 g，赤芍15 g，當歸 12 g，生地 10 g，益母草 15 g，茜草 10 g，生甘草10 g，每日1劑，水煎服，早晚各1次。對照組在西醫(yī)綜合治療方案基礎上予1/10治療中藥量聯(lián)合模擬劑治療，每日1劑，水煎服，早晚各1次。兩組均連續(xù)治療3個月。

1.5 觀察指標

1.5.1 外周血細胞計數(shù) 每2周用COULTER LH750全自動血細胞分析儀檢測1次。

1.5.2 T淋巴細胞亞群 患者分別于治療前后使用BECKMAN-COULTER公司的Cytomics FC 500流式細胞儀檢測CD4+、CD8+、CD4+CD25+T細胞亞群各1次。所用單克隆抗體CD3-PerCp、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子（Foxp3）-PE及其同型陰性對照抗體均購自BECKMAN公司，破膜/固定劑購自eBioscience公司，佛波酯、離子霉素購自Sigma公司。用Cytomics FC 500自帶軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 療效標準 考慮研究成果與國際接軌和臨床操作的方便性，療效評價標準參考英國血液學會AA診治指南中AA免疫抑制療效標準，分為完全有效、部分有效、無效[6]。其中完全有效必須同時滿足以下 4項：1）血紅蛋白≥120 g/L（男性），≥110 g/L（女性）。2）中性粒細胞≥1．5×109/L。3）血小板≥100×109/L。4）脫離輸血。部分有效同時滿足以下2項：1）脫離輸血。2）不符合SAA診斷標準。無效：仍完全符合SAA診斷標準。療效判定需至少參考連續(xù)2次以上的外周血象（每次間隔＞4周），期間也未曾接受成分輸血或細胞因子治療。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22．0統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料用頻數(shù)表示。計量資料滿足正態(tài)分布且方差齊性，同組治療前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用成組t檢驗。等級資料組間比較采用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床療效比較 治療組完全有效8例，部分有效17，無效5例；對照組完全有效5例，部分有效16例，無效9例。治療組、對照組臨床總有效率分別為 83．33%、70．00%，兩組總有效率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表 1。

表1 兩組臨床療效比較Tab.1 Comparison of clinical effects between two groups 例

2.2 兩組治療前后外周血細胞計數(shù)比較 治療前兩組外周血細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），治療組治療后白細胞、紅細胞、血紅蛋白計數(shù)、血小板計數(shù)明顯上升，與治療前相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05 或 P＜0．01）。對照組治療后紅細胞、血紅蛋白計數(shù)及血小板計數(shù)上升，與治療前相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。治療后治療組血紅蛋白計數(shù)高于對照組（P＜0．05）。見表 2。

2.3 兩組治療前后T淋巴細胞亞群比例分析 治療組治療后CD3+CD4-CD8+細胞比例降低，CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞比例升高，與治療前相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。且 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞比例與對照組治療后比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。對照組各項治療前后差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表 3。

3 討論

SAA是免疫介導的造血功能衰竭綜合征，臨床上表現(xiàn)為嚴重的感染、出血和貧血，屬于中醫(yī)“虛勞”“髓勞”等范疇?！端貑枴ねㄔu虛實論》云：“精氣奪則虛?！睔v代醫(yī)家對虛勞多有論著[7]，本科已故吳翰香老先生提出，SAA所屬“虛勞”并非廣義虛勞，而是《醫(yī)門法律》中所載的虛勞，其指髓不生血，營血不榮于五臟六腑，繼而時邪外襲，火熱迸入，“營血為衛(wèi)氣所迫，不能內守而脫出于外”，見諸血證。髓不生血（貧血）是虛勞的病之根本，火熱迸入和營不內守（感染和出血）為因虛致病，是病之變端，這和現(xiàn)代SAA的臨床表現(xiàn)極為相似[8]。

虛勞的發(fā)生涉及五臟，但最基本病機在于脾腎。誠如《類證治裁》中曰：“凡虛損多起于脾腎，勞瘵多起于腎?！蹦I為先天之本，藏精主骨生髓，為陰陽之根，而脾為后天之本，氣血生化之根本，主運化統(tǒng)血?！熬ド薄皻庋础?，腎虛則精氣虧虛無以生髓化血，脾虛則氣血生化無源?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩疲骸肮撬鑸怨?，氣血皆從?！斌w現(xiàn)骨髓與氣血的緊密關系，腎中精氣充盈依賴于脾胃化生精微的榮養(yǎng)，脾腎俱虛終會導致氣血陰陽的失調。西醫(yī)學證實SAA病理基礎為骨髓造血功能衰竭，這與腎藏精生髓，以及髓血同源的中醫(yī)理論相契合。在虛損表現(xiàn)的同時，SAA患者往往合并有感染、出血，然此兩者實為標實，病之根本仍在脾腎虧虛。因氣虛血虧以致衛(wèi)外不固，易感外邪，正邪相爭，引起感染發(fā)熱；或精虧氣虛以致陰火內生，陰陽不相為守，迫血外行，見之于出血，因虛致病，故補腎健脾確為中醫(yī)治則的關鍵。

SAA患者除虛勞、發(fā)熱、血證表現(xiàn)之外，亦常會出現(xiàn)瘀血內阻之候，如皮下瘀點瘀斑、肌膚甲錯、舌紫黯、脈澀等。究其原因，其一是虛勞和血瘀兩者有著“因虛致瘀、因瘀致虛”的相互關系，《金匱要略》指出：“五勞虛極贏瘦，腹?jié)M不能飲食……經(jīng)絡營衛(wèi)氣傷，內有干血，肌膚甲錯，兩目黯黑，緩中補虛，大黃蟄蟲丸主之?！睘榛钛龇ㄖ委熦氀峁┝死碚撘罁?jù)；其二是因邪致瘀，反復出血及熱迫血行造成的離經(jīng)之血，使得血不歸經(jīng)，形成瘀血。所謂“瘀血不去，新血不生”，瘀血內停致髓海瘀阻，影響造血功能。同時，瘀血不僅是AA病程中脾腎虧虛造成的病理產物，它的存在亦可加重出血感染，變生諸證，纏綿難愈，故應在補腎健脾治則的基礎上兼用活血祛瘀法，兩者相輔相成[9-10]。現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，SAA有骨髓微血管破壞、血管新生減少和基質細胞缺陷的病理改變，造成骨髓脂肪化加速、細胞因子分泌紊亂、抑制造血功能[11-12]。實驗證明活血祛瘀藥恰能改善骨髓微環(huán)境、調節(jié)機體免疫功能、促進正常造血細胞增殖分化，是治療貧血的有效方法[13-14]。

本研究補腎健脾活血方中，運用六味地黃丸合四君子湯加減，熟地黃補血滋陰、益髓填精，與山茱萸、山藥形成三陰并補，牡丹皮、茯苓防滋膩太過，同時根據(jù)陰陽互根，孤陰不生、孤陽不長之理論，予鹿角膠、仙茅、仙靈脾溫補腎陽，共治腎虛髓枯之證?！耙磺醒a氣之方，皆出于四君”，方中黨參、白術、茯苓、甘草共奏益氣健脾之功，以資氣血生化之源，加用炙黃芪補氣升陽，與養(yǎng)血和營之當歸合用，使陽生陰長，氣旺血生。SAA患者臨床常見出血，方中生龍骨、生牡蠣、山茱萸出自補絡補管湯（《醫(yī)學衷中參西錄》方），取其收斂止血之意。赤芍、茜草、益母草活血化瘀，以達“以通為用”的目的，與止血藥相伍，一收一散，止血不留瘀，活血不肆溢。諸藥合用，補腎健脾，使先天后天相互為用，兼用活血化瘀藥，以奏祛瘀生新、瘀除邪退之功。

表2 兩組治療前后外周血細胞計數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of peripheral blood cell count before and after treatment between two groups（±s）

表2 兩組治療前后外周血細胞計數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of peripheral blood cell count before and after treatment between two groups（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與對照組治療后比較，#P＜0．05。

組別 白細胞（×109/L） 紅細胞（×1012/L） 血紅蛋白（g/L） 血小板計數(shù)（×109/L）對照組 2．95±1．46 2．67±1．06 83．71±35．76 48．53±39．31 3．16±1．72 2．94±0．94* 89．49±32．32* 57．42±45．05*治療組 2．98±1．75 2．81±0．92 79．20±30．60 51．54±49．74 3．44±1．88* 3．21±0．92** 103．03±30．21**# 63．17±61．75*例數(shù)30 30治療時點治療前治療后治療前治療后

表3 兩組治療前后T淋巴細胞亞群比例分析（±s）Tab.3 Analysis of T-lymphocyte subsets before and after treatment between two groups（±s）%

表3 兩組治療前后T淋巴細胞亞群比例分析（±s）Tab.3 Analysis of T-lymphocyte subsets before and after treatment between two groups（±s）%

注：與本組治療前比較，*P＜0．05；與對照組治療后比較，#P＜0．05。

組別 CD3+CD19-細胞 CD3+CD4+CD8-細胞 CD3+CD4-CD8+細胞 CD3+CD4+CD8+細胞 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞對照組 75．62± 9．86 39．69±10．05 32．93±11．71 0．61±0．45 21．83± 9．71 73．78±12．89 40．38± 9．49 30．53±11．25 0．63±0．35 22．11±10．47治療組 74．52±15．76 36．88±12．93 33．53±13．68 0．59±0．66 22．79± 7．88 72．18±16．66 37．21± 9．52 24．98±14．85* 0．74±0．64 30．88±10．16*#例數(shù)30 30治療時點治療前治療后治療前治療后

目前ATG聯(lián)合CsA是IST的標準方案，治療6個月時大約有70%SAA患者有血液學反應[15]。本研究結果顯示，免疫抑制劑聯(lián)合中醫(yī)“補腎健脾活血”法治療SAA可有效改善患者外周血象，使白細胞、血小板均有提升，尤其對紅細胞、血紅蛋白有顯著提高作用，且總有效率優(yōu)于照組相。

大量研究表明，AA造血功能衰竭與免疫機制異常相關，T淋巴細胞亞群比例失調，CD4+T細胞減少，而CD8+T細胞增加，異?；罨疌D8+T細胞可通過細胞毒作用直接抑制骨髓造血干細胞增殖，同時也可以通過釋放大量造血負向調控因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等誘導造血干細胞凋亡從而抑制骨髓造血[16-17]。本研究結果顯示，治療組治療后，CD3+CD4-CD8+細胞比例降低，CD3+CD4+CD8-細胞比例及CD4+/CD8+比值均上升。由此提示“補腎健脾活血”法可能通過抑制CD8+T細胞過度活化，調節(jié)T淋巴細胞亞群比例，促進SAA患者早期骨髓造血的恢復。

研究發(fā)現(xiàn)，AA患者與正常人相比較，存在調節(jié)性T細胞（Treg）比例及絕對值數(shù)降低，并與疾病的嚴重程度呈正相關[18-19]。所以，Treg細胞數(shù)量減少、功能低下，進而導致效應T細胞的異常增殖活化，在AA發(fā)病中有重要作用。Foxp3是Treg細胞產生功能的關鍵性調節(jié)基因，特異性表達于Treg細胞，CD4+CD25+Foxp3+細胞的存在抑制了效應T細胞的活化，而其減少會使人體免疫調節(jié)機制發(fā)生異常進而導致AA的發(fā)生[20-21]。本研究結果示，治療組治療后 CD4+CD25+Foxp3+較治療前升高（P＜0．05），且與對照組相比增高明顯（P＜0．05），提示“補腎健脾活血”法可以通過提高Foxp3的表達，從而增強Treg的免疫功能，維持機體免疫平衡，恢復骨髓造血。