注射型富血小板纖維蛋白對成骨細胞影響的研究

費 潛，王燦莉，孫 勇

(1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)在2001年由法國科學家 Choukroun 等[1]發(fā)現(xiàn)，是繼富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)后第二代血小板濃縮制品。PRF主要是由血小板、白細胞和纖維蛋白基質(zhì)等共同構(gòu)成，其分子結(jié)構(gòu)類似于天然血凝塊，富含多種細胞因子。PRF可以借助生長因子的調(diào)節(jié)作用進行組織修復，具有誘導組織再生和促進組織愈合的特性[2]。另外，PRF是一種不含體外抗凝物質(zhì)的完全自體血濃縮物，不但內(nèi)含大量生長因子，且具有獲取途徑容易，制作過程簡單的優(yōu)點[3]。PRF目前已廣泛應用于臨床，使用時主要制備成膜狀或凝膠狀。2014年，Choukroun團隊通過改變離心速率制得注射型富血小板纖維蛋白(injectable platelet-rich fibrin，i-PRF)，通過利用非玻璃離心管在低速離心狀態(tài)下，降低纖維蛋白早期凝集，從而獲得i-PRF[4]。臨床使用時其制備方法更加簡化，為一步離心，操作更加便捷，不需要膜狀或凝膠狀的剪切和擠壓塑性。i-PRF同傳統(tǒng)的PRF類似，但i-PRF富含更多的白細胞，以及能夠釋放更多的生長因子[4]。本實驗使用的是i-PRF，觀察其對成骨細胞增殖、分化及細胞骨架的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone 美國)、胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司)、CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海生工有限公司)、羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton 美國)、圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics美國)、低速離心機(湖南恒心科技股份有限公司，型號：0TD3WS)。

1.2 方法

1.2.1兔成骨細胞的制備 2017年12月至2018年6月，選擇 出生一周的同胎新西蘭乳兔4只(20～25 g，西南醫(yī)科大學實驗動物房提供)。頸椎脫臼法處死后置于75%酒精中浸泡30 min，無菌操作臺內(nèi)取出顱頂骨，通過改良膠原酶和胰酶分段消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法獲取兔原代成骨細胞。通過堿性磷酸酶染色和茜紅素染色法進行成骨細胞鑒定后取P3代細胞進行實驗。

1.2.2i-PRF的制備 新西蘭大白兔(2～2.5 kg 西南醫(yī)科大學實驗動物房提供)，適應性飼養(yǎng)1周。無菌條件下，于每次兔子進食后1 h后進行動脈血采集，一次性靜脈采血針配合i-PRF專用一次性真空采血管，每只兔子每次收集7 ml血液，立即置入TD3WS低速離心機(湖南恒心科技股份有限公司)中，設置i-PRF程序700 rpm/min，3 min，離心后可見血液分為2層：上層為i-PRF層，下層為紅細胞層。在超凈工作臺上，將每1 ml i-PRF加入5 ml α-MEM培養(yǎng)基，靜置3天后，1000 rmp條件下離心5 min，取上清液用0.22 μm細菌濾器過濾后即為i-PRF條件培養(yǎng)基。實驗分為實驗組(i-PRF組)，對照組(α-MEM完全培養(yǎng)基 含10%FBS、2%雙抗)進行培養(yǎng)成骨細胞。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 重懸細胞，將細胞計數(shù)調(diào)整為1×105個/ml，取96孔板，表明時間節(jié)點，每組設置5個復孔，每孔加入50 μl上述細胞懸液，移入孵育箱2 h后取出，實驗組每孔按4∶1的比例加入i-PRF條件培養(yǎng)基和α-MEM完全培養(yǎng)基共100 μl，空白組加入α-MEM完全培養(yǎng)基100 μl，每2～3天換液。分別培養(yǎng)1、3、5、7天后，吸出原培養(yǎng)液，無菌PBS漂洗三次，向上述各孔加入CCK-8反應液10 μl。按照CCK-8檢測試劑盒說明書進行操作，酶標儀450 nm處進行OD值檢測并記錄結(jié)果。

1.2.4堿性磷酸酶(ALP)染色 將細胞計數(shù)約1×105個/ml的細胞懸液接種至24孔板，設置3個復孔，移入孵育箱2 h后取出，實驗組每孔按4∶1的比例加入i-PRF條件培養(yǎng)基和α-MEM完全培養(yǎng)基共100 μl，空白組加入α-MEM完全培養(yǎng)基100 μl，每2～3天換液。于細胞培養(yǎng)第5、7、9天，吸去培養(yǎng)液，無菌PBS漂洗三次，取細胞爬片進行堿性磷酸酶檢測并通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析。

1.2.5細胞骨架形態(tài)觀察 將細胞以1×105個/ml的濃度置于6孔板中制作細胞爬片。每組每個時間節(jié)點設3個復孔，分別于12、24、48 h后吸去培養(yǎng)液，無菌PBS漂洗三次，4%多聚甲醛溫室固定10 min，PBS清洗30 s，0.5%Triton X-100溶液完全覆蓋細胞，溫室處理5 min，PBS清洗30 s，滴加200 μl 10 nm的羅丹明-鬼筆環(huán)肽，室溫避光處理30 min，PBS清洗30 s，在熒光顯微鏡下進行細胞骨架形態(tài)及細胞核觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0進行t檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差表示。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測細胞增殖結(jié)果隨細胞培養(yǎng)時間延長，兩組細胞數(shù)量逐漸增加，各組細胞培養(yǎng)的OD值總體比較及不同時點組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；在每個時間節(jié)點實驗組的吸光度值均顯著高于對照組(P< 0.05)。見表1。

表1 兩組細胞不同培養(yǎng)時間細胞增殖結(jié)果OD值比較

2.2 兩組ALP染色結(jié)果比較隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，鏡下成骨細胞數(shù)目及表達藍染顆粒的細胞數(shù)目均增加，5、7、9天細胞內(nèi)堿性磷酸酶藍染顆粒表達情況均表現(xiàn)為實驗組優(yōu)于對照組(P<0.05)。見圖1。2.3 i-PRF對細胞骨架形態(tài)的影響觀察對照組和實驗組成骨細胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，兩組細胞均表現(xiàn)出較好的增殖活性。成骨細胞培養(yǎng)的第12 h，空白組細胞呈現(xiàn)為較小的橢圓形，邊緣光滑整齊，無明顯的細胞突起，可見F-actin微絲蛋白環(huán)狀排列；實驗組細胞開始呈現(xiàn)出成骨細胞三角形、長梭形、多邊形等特點，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細胞長軸平行排列。成骨細胞培養(yǎng)的第24 h，對照組細胞開始呈現(xiàn)長梭形樣伸展并可見胞漿突起，F(xiàn)-actin微絲蛋白開始沿細胞長軸平行排列；實驗組細胞主要呈現(xiàn)為三角形、多邊形伸展，細胞伸展面積較對照組大，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細胞長軸有規(guī)律的平行排列或交織成網(wǎng)狀。成骨細胞培養(yǎng)的第48 h，對照組細胞呈現(xiàn)為多邊形伸展伴多個胞漿突起，伸展面積較前一時間節(jié)點明顯擴大，F(xiàn)-actin微絲蛋白沿細胞長軸平行排列或交織成網(wǎng)狀，排列相對紊亂；i-PRF組細胞呈現(xiàn)為三角形、多邊形及長梭形伸展，伴豐富胞漿突起并相互連接，細胞伸展面積明顯較空白組大，F(xiàn)-actin微絲蛋白匯集成較粗的束狀，均勻、平行排列，規(guī)律性的沿細胞長軸伸展。見圖2。

圖1 兩組細胞不同培養(yǎng)時間ALP細胞染色結(jié)果比較 (×200) a：對照組5天；b：對照組7天；c：對照組9天；d：實驗組5天；e：實驗組7天；f：實驗組9天

圖2 兩組細胞培養(yǎng)不同時間節(jié)點細胞骨架形態(tài)比較(熒光顯微鏡，×400) a：對照組12 h；b：對照組24 h；c：對照組48 h；d：實驗組12 h；e：實驗組24 h；f：實驗組48 h

3 討論

大量研究[5，6]證明，PRF可以有助于傷口愈合，保護術(shù)區(qū)，促進軟組織修復的作用，當與骨移植材料混合時，可以促進干細胞向移植中心遷徙，促進新的血管形成。相關(guān)的動物實驗中已經(jīng)證實PRF不僅具有促進新骨形成的作用，且可作為骨組織工程支架材料的選擇之一[7]。另外，有實驗表明PRF可以單獨作為骨充填材料修復種植體周圍骨缺損，且修復的新骨與正常骨無明顯差異[8]。PRF中主要含有三種濃縮的細胞因子生長因子-β(TGF-β)、血小板生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。PDGF在骨細胞的分裂和增殖的早期階段起著重要作用；TGF-β可以調(diào)節(jié)骨形成和吸收；VEGF是骨代謝的一種重要的局部調(diào)節(jié)因子，在一定劑量時則以發(fā)揮成骨的調(diào)節(jié)效應，可以直接作用于成骨細胞。它們之間存在協(xié)同作用，加強各自的促進作用[9]。i-PRF作為一種新型的不加入任何抗凝劑的可注射型富血小板纖維蛋白，通過低速離心(700 rmp，3 min) 即可制得[4]。有實驗表明i-PRF較PRF能更好的誘導成骨細胞遷徙，并釋放不同濃度的生長因子的能力，更高的表達PDGF，TGF-β等[10]。Choukroun等[3]一項研究證明了降低離心力與生長因子釋放之間的關(guān)系，離心過程產(chǎn)生的總細胞數(shù)量和生長因子釋放水平在相同的血容量下只與特定的相關(guān)離心力暴露量有關(guān)。目前新的數(shù)據(jù)表明，白細胞和血小板的質(zhì)量、大小和密度范圍需要較低的相關(guān)離心力，這足以讓它們從血液中分離出來，且顯著增加白細胞、血小板數(shù)量，以及生長因子濃度[11]。且有進一步的研究顯示，i-PRF與骨移植材料混合時，可形成一移植骨塊，最大限度的減少骨移植顆粒的擴散和遷移[12]。但有研究指出，過高濃度的生長因子會抑制細胞的增殖分化[13]，本實驗于無菌條件下，制取得到i-PRF條件培養(yǎng)液后稀釋至20%用于本實驗，與Miron等[10]在實驗中采用的i-PRF濃度一致。

本實驗中，CCK-8結(jié)果顯示，隨細胞培養(yǎng)時間延長，兩組細胞數(shù)量逐漸增加，各組細胞培養(yǎng)1、3、5、7 d的OD值兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；在每個時間節(jié)點實驗組的吸光度值均顯著高于對照組(P< 0.05)。此結(jié)果與董凱等[14]對富血小板纖維蛋白提取液(platelet-rich fibrin extrace，PRFe)對成骨細胞的實驗研究中，細胞增殖情況結(jié)果基本一致。本實驗 ALP染色結(jié)果顯示隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，鏡下成骨細胞數(shù)目及表達藍染顆粒的細胞數(shù)目均增加，5、7、9 d細胞內(nèi)堿性磷酸酶藍染顆粒表達情況均表現(xiàn)為實驗組優(yōu)于對照組。其原因筆者認為通過低速離心獲得的i-PRF富含多種生長因子、白細胞及血小板，對成骨細胞表達堿性磷酸酶活性起著促進作用，但本實驗未對成骨細胞表達堿性磷酸酶活性進行定量檢測，這一假設仍需進一步研究來證實。本實驗 i-PRF對細胞骨架形態(tài)的影響觀察結(jié)果顯示，對照組和實驗組成骨細胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，兩組細胞均表現(xiàn)出較好的增殖活性，但實驗組細胞的細胞骨架較對照組有更好的排列及伸展。初步分析其原因與i-PRF中釋放的多種生長因子有密切關(guān)系，但實驗中未討論i-PRF的三維結(jié)構(gòu)對成骨細胞的影響，仍須今后進一步實驗研究。i-PRF運用時間較短，其生物性能有待進一步研究，需要進一步的相關(guān)臨床和實驗研究以優(yōu)化臨床效益。

綜上所述，i-PRF能夠釋放一定濃度的生長因子促進成骨細胞增殖分化，促進細胞骨架的排列與伸展。這為臨床種植手術(shù)中的應用提供了進一步的理論基礎(chǔ)。