白花蛇舌草紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法

楊新周，董 毅，黨菱婧，田孟華，田先嬌，馬艷粉

(1.德宏師范高等?？茖W校民族醫(yī)藥研究所，云南 芒市 678400；2.德宏師范高等?？茖W校理工學院，云南 芒市 678400；3. 德宏職業(yè)學院，云南 芒市 678400；4.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000)

【研究意義】白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.) 屬茜草科(Rubiaceae)耳草屬植物[1-2]，傣語稱“芽零哦”。隨著環(huán)境不斷惡化，白花蛇舌草的生長環(huán)境遭到破壞，市場上出現(xiàn)偽劣假冒的白花蛇舌草藥材，故加強滇產(chǎn)白花蛇舌草的質(zhì)量控制與鑒別十分重要。【前人研究進展】目前白花蛇舌草的研究主要集中于化學成分[3-5]、藥理藥效及活性等方面[6-8]。對云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的鑒別研究未見報道?！颈狙芯康那腥朦c】依據(jù)紫外光譜的指紋特性，利用紫外光譜法對云南省不同產(chǎn)區(qū)的白花蛇舌草進行鑒別。【擬解決的關(guān)鍵問題】應用多維共有峰率和變異峰率雙指標系列法建立白花蛇舌草的紫外指紋圖譜，為不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品(S1～S23)采自云南23個不同產(chǎn)區(qū)，經(jīng)德宏師專施洪教授鑒定為茜草科(Rubiaceae)耳草屬植物白花蛇舌草干燥全草，樣品信息見表1。乙酸乙酯、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，AR)。

1.2 儀器

電子天平(AL204，METTLER TOLEDO)，高速萬能粉碎機(FW-100，天津市華鑫儀器廠)；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限公司)，超聲波清洗機(WF-500E，寧波海曙五方超聲設備有限公司)。

1.3 樣品前處理及測定方法

1.3.1 樣品的制備 白花蛇舌草洗凈晾干，粉碎，過0.3 mm篩，制得樣品。

1.3.2 測試液的制備及試驗條件 精確稱取樣品0.5000 g(平行3份)于50 mL具塞三角瓶中，依次用25 mL乙酸乙酯、甲醇、水在超聲條件下提取一定的時間，過濾，稀釋定容到25 mL容量瓶中，即得到乙酸乙酯、甲醇、水溶液的樣品溶液。將樣品溶液在190～400 nm掃描波長范圍內(nèi)，2.0 nm狹縫寬度，0.5 nm的采樣間隔條件下進行測定。測定中分別以乙酸乙酯、甲醇、水作為參比溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜信號預處理

為了消除測試過程中的基線漂移、背景噪音、克服光譜帶重疊問題，采用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計紫外軟件對白花蛇舌草紫外光譜數(shù)據(jù)進行一定的處理(3組平均，9點平滑，二次微分)，通過光譜預處理，可以提高光譜的分辨率、強化譜帶特征[6]。

2.2 最佳提取時間優(yōu)化

為了研究出最佳提取時間，依次采用乙酸乙酯、甲醇、水對樣品S11進行超聲提取20、30、40、50 min，提取液過濾定容到25 mL，其中甲醇、水提取液稀釋10倍后測定，制備的試液按照1.3.2的測定條件進行測試，以提取峰為條件確定不同提取溶劑的最佳提取時間，經(jīng)過實驗得出，乙酸乙酯、乙醇、水最佳提取時間分別為30、40、30 min，在此條件下，乙酸乙酯、甲醇、水3種溶劑的提取峰數(shù)最多，效果最佳。

2.3 指紋圖譜穩(wěn)定性實驗

將樣品S11的乙酸乙酯、甲醇、水等3種溶劑的提取液存放于0～4 ℃的冰箱中，分別于0、5、24、48、60 h按照1.3.2測定3次，以提取峰的波長進行計算，結(jié)果乙酸乙酯、甲醇、水等3種溶劑制備的提取液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜重現(xiàn)性實驗

分別稱取樣品S11 5份(0.5 g/份)，按照1.3.2進行樣品液制備、測定，以乙酸乙酯、甲醇、水提取物的波長計算RSD，3種提取物的RSD分別為0～0.47 %，0.26 %～0.64 %，0～0.50 %，說明在此提取條件下，白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水提取液的重現(xiàn)性較好。

圖1 白花蛇舌草乙酸乙酯提取物紫外指紋圖譜

圖2 白花蛇舌草甲醇提取物紫外指紋圖譜

2.5 不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草紫外指紋圖譜

圖1～3為不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草紫外指紋圖譜。

2.6 白花蛇舌草紫外指紋圖譜共有峰率及變異峰率的確定

通過對白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水提取物進行光譜測定后，依據(jù)吸收峰最大差異是否小于相鄰組之間的平均波數(shù)差將不同溶液測定吸收峰分組，通過判定，若小于則為共有峰，若大于則為變異峰[9-10]。通過式(1)、(2)、(3)計算出不同產(chǎn)地白花蛇舌草之間的共有峰率和變異峰率：

P(%)=(Ng/Nd) ×100

(1)

Pva(%)=(na/Ng) ×100

(2)

Pvb(%)=(nb/Ng) ×100

(3)

式中,P為共有峰率；Pva,Pvb分別為a、b圖譜的變異峰率；Ng為2個圖譜中共有峰數(shù)；Nd為獨立峰數(shù)；na，nb分別為a、b圖譜的變異峰數(shù)，其中，Nd=Ng+na+nb[11-15]。

2.7 不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草共有峰的識別

不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草依次經(jīng)過乙酸乙酯、甲醇、水超聲提取后，經(jīng)紫外光譜檢測，得到紫外指紋圖譜吸收波數(shù)和共有峰的識別數(shù)據(jù)，其中乙酸乙酯提取物共有峰主要在249、259、264、272、288、293、318、328、352、386 nm附近，甲醇提取物共有峰主要在191、202、207、210、213、217、222、273 nm附近，水提取物共有峰主要在191、201、204、207、249 nm附近。

2.8 基本關(guān)系組、對及分析

測試不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水溶劑的制備液，對3種溶液的原始紫外光譜圖進行平均、平滑、微分處理，利用式(1)、(2)、(3)計算出不同產(chǎn)地白花蛇舌草之間的共有峰率和變異峰率，按照共有峰率從大到小的順序排列，建立不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的共有峰率和變異峰率雙指標序列。通過共有峰率和變異峰率雙指標序列可以描述不同產(chǎn)地之間白花蛇舌草的親緣遠近關(guān)系，共有峰率越大說明兩個樣品的紫外圖譜之間相似程度越高，變異峰率越大，說明兩個樣品之間差異性越大。通過共有峰率的平均值可以反應云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的相似性整體水平，共有峰率大于平均值的說明兩個樣品之間變異率小，相似性高。

圖3 白花蛇舌草水提取物紫外指紋圖譜

通過計算，云南23個不同產(chǎn)區(qū)的白花蛇舌草組成的共有峰率和變異峰率系列中，共有峰率和變異峰率都存在差異，說明23個不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草之間存在差異。由于23個產(chǎn)區(qū)的氣溫、降雨量、海拔、生長的地理環(huán)境不同，導致不同產(chǎn)區(qū)的白花蛇舌草之間相同的化學成分含量不同或是化學成分種類不同，致使不同產(chǎn)區(qū)之間白花蛇舌草存在差異。通過建立不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草紫外指紋圖譜的共有峰率和變異峰率雙指標序列，可以找到不同產(chǎn)區(qū)之間的相似樣品。從表2中得出，云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的總體相似度在22.2 %～92.3 %，其中樣品S3和S14，S4和S5、S5和S23、S6和S18、S7和S16、S8和S21、S13和S15共有峰率均在75 %以上，說明以上2個樣品之間相似程度較高。

表2 相似白花蛇舌草藥材的共有峰率和變異峰率

續(xù)表1 Continued table 1

序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; PvbS13∶S8(73.3;9.1;27.3)S14∶S22(76.9;10;20)S11∶S23(54.5;41.7;41.7)S16∶S20(70.6;25;16.7)S13∶S19(73.3;9.1;27.3)S14∶S5(73.3;0;36.4)S11∶S6(52.6;70;20)S16∶S13(68.8;36.4;9.1)S13∶S20(73.3;9.1;27.3)S14∶S21(71.4;10;30)S11∶S13(52.6;70;20)S16∶S23(68.4;15.4;30.8)S13∶S22(71.4;20;20)S14∶S8(66.7;10;40)S11∶S16(52.4;54.5;36.4)S16∶S5(66.7;25;25)S13∶S16(68.8;9.1;36.4)S14∶S4(64.7;0;54.5)S15∶S13(84.6;9.1;9.1)S16∶S21(64.7;36.4;18.2)S13∶S12(62.5;20;40)S14∶S6(64.3;22.2;33.3)S15∶S19(73.3;9.1;27.3)S16∶S17(61.1;27.3;36.4)S17∶S4(73.7;14.3;21.4)S14∶S15(64.3;22.2;33.3)S15∶S6(71.4;20;20)S16∶S3(58.8;50;20)S17∶S23(73.7;14.3;21.4)S14∶S18(60;22.2;44.4)S15∶S21(66.7;20;30)S16∶S15(58.8;50;20)S17∶S5(72.2;23.1;15.4)S14∶S23(58.8;10;60)S15∶S18(66.7;20;30)S20∶S21(80;16.7;8.3)S17∶S7(66.7;33.3;16.7)S18∶S6(92.3;7.7;0)S15∶S14(64.3;33.3;22.2)S20∶S10(73.3;27.3;9.1)S17∶S12(66.7;33.3;16.7)S18∶S15(66.7;30;20)S15∶S7(62.5;20;40)S20∶S13(73.3;27.3;9.1)S17∶S21(61.1;45.5;18.2)S18∶S14(60;44.4;22.2)S15∶S8(62.5;20;40)S20∶S23(72.2;7.7;30.8)S17∶S16(61.1;36.4;27.3)S18∶S19(58.8;30;40)S15∶S20(62.5;20;40)S20∶S5(70.6;16.7;25)S17∶S2(58.8;50;20)S18∶S13(56.3;44.4;33.3)S15∶S11(61.1;9.1;54.5)S20∶S16(70.6;16.7;25)S17∶S10(58.8;60;10)S18∶S22(56.3;44.4;33.3)S15∶S22(60;33.3;33.3)S20∶S7(64.7;27.3;27.3)S17∶S8(57.9;45.4;27.3)S18∶S10(55.6;85.7;71.4)S15∶S16(58.8;20;50)S20∶S8(64.7;27.3;27.3)S17∶S20(57.9;45.5;27.3)S18∶S21(52.9;44.4;44.4)S15∶S23(58.8;20;70)S20∶S19(64.7;27.3;27.3)S21∶S8(80;8.3;16.7)S18∶S5(52.6;40;50)S19∶S8(75;16.7;16.7)S20∶S4(63.2;16.7;41.6)S21∶S20(80;8.3;16.7)S22∶S14(76.9;20;10)S19∶S13(73.3;27.3;9.1)S20∶S11(63.2;16.7;41.7)S21∶S13(78.6;18.2;9.1)S22∶S13(71.4;20;20)S19∶S15(73.3;27.3;9.1)S20∶S15(62.5;40;20)S21∶S10(78.6;18.2;9.1)S22∶S19(62.5;20;40)S19∶S21(68.8;27.3;18.2)S20∶S22(62.5;40;20)S21∶S23(76.5;0;30.8)S22∶S20(62.5;20:40)S19∶S9(66.7;40;10)S23∶S5(82.3;14.3;7.1)S21∶S5(75;8.3;25)S22∶S15(60;33.3;33.3)S19∶S7(64.7;27.3;27.3)S23∶S21(76.5;30.8;0)S21∶S14(71.4;30;10)S22∶S3(60;33.3;33.3)S19∶S12(64.7;27.3;27.3)S23∶S7(76.5;23.8;7.7)S21∶S19(68.8;18.2;27.3)S22∶S5(58.8;20;50)S19∶S20(64.7;27.3;27.3)S23∶S8(76.5;23.1;7.7)S21∶S15(66.7;30;20)S22:S7(56.3; 33.3;66.7)S19∶S11(63.2;16.7;41.7)S23∶S17(73.7;21.4;14.3)S21:S4(66.7; 8.3;41.7)S22:S18(56.3; 33.3;44.4)S19:S23(63.2;16.7;41.7)S23:S4(73.7; 14.3;21.4)S21:S16(64.7; 18.2;36.4)S22:S21(56.3; 33.3;44.4)S19:S22(62.5;40;20)S23:S20(72.2; 30.8;7.7)S19:S10(62.5;40;20)S23:S10(70.6;29.4;0)S23:S16(68.4; 30.8;15.4)S23:S19(63.2; 41.7;16.7)

3 討 論

利用乙酸乙酯、甲醇、水為溶劑，依據(jù)極性順序：乙酸乙酯<甲醇<水，依次對白花蛇舌草進行超聲提取，利用紫外光譜法測定不同提取溶液中的紫外吸收光譜，采取平均、平滑、積分的手段建立紫外指紋圖譜和雙指標序列。通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同溶液的提取物紫外光譜存在差異，是由于不同極性溶劑可以提取出白花蛇舌草中不同極性的化學成分。通過建立白花蛇舌草紫外指紋圖譜雙指標系列，可以探究出不同產(chǎn)區(qū)之間的相似樣品。云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的總體相似度在22.2 %～92.3 %，其中樣品S3和S14、S4和S5、S6和S18、S7和S16、S13和S15等不同產(chǎn)區(qū)的共有峰率均在75 %以上，說明以上2個樣品之間相似程度較高。通過比較發(fā)現(xiàn)S3和S14的生長地均為亞熱帶季風氣候，年平均降雨量1530～1565.8 mm，全年無霜期較多。S4和S5樣品均生長在德宏州境內(nèi)，屬于亞熱帶季風氣候，年平均降雨量1400～1800 mm。S6和S18生長地年平均氣溫為17.8 ℃左右，S7和S16樣品生長地海拔分別為1437、1515 m，年平均氣溫分別為18、16 ℃，S7和S16樣品生長地海拔和氣溫差距較小。S13和S15生長地均在普洱市境內(nèi)，屬于熱帶季風氣候。不同產(chǎn)地之間的白花蛇舌草具有很高的相似度是因為生長的地方氣溫、氣候類型、年降雨量、日照時間、無霜日、生長的土壤等具有類似的特點。云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草之間的相近情況能夠被紫外指紋圖譜中共有峰率和變異峰率體現(xiàn)出來，為白花蛇舌草的研究奠定一定的基礎。

4 結(jié) 論

采用紫外分光光度法測定云南23個不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草190～400 nm 紫外圖譜，通過實驗發(fā)現(xiàn)最佳稱樣量為0.5 g，乙酸乙酯、甲醇和水3種溶劑最佳提取時間分別為30、40、30 min，3種溶劑提取液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。白花蛇舌草紫外指紋圖譜顯示，白花蛇舌草不同產(chǎn)區(qū)樣品間最大共有峰率為92.3 %，最小共有峰率為22.2 %。采用紫外光譜法測試手段并結(jié)合雙指標(共有峰率和變異峰率)序列分析法，構(gòu)建的云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的紫外指紋圖譜，可闡明不同產(chǎn)區(qū)間白花蛇舌草的相似程度和差異，為白花蛇舌草的鑒定及其品質(zhì)鑒定評價奠定基礎。