慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)Cpf1的細(xì)胞系的構(gòu)建及其基因編輯效率驗(yàn)證

覃鴻妮，謝鈺珍，陳 罡，密苗苗，彭賽男, 張 勇*

(1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.金唯智生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215123；3.斯澳生物科技(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215123)

【研究意義】慢病毒載體是一種強(qiáng)大、靈活的載體工具，可以在體外和體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移至分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。慢病毒載體因?yàn)槠洫?dú)有的特點(diǎn)，在近年引發(fā)了不同領(lǐng)域的關(guān)注，這些載體被大量的應(yīng)用在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和人類基因治療等領(lǐng)域[1-7]。【前人研究進(jìn)展】CRISPR短回文重復(fù)序列的研究始于1987年[8-9]；2013年，張峰等首次在哺乳動(dòng)物基因組中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)并成功的達(dá)到了基因編輯的效果，這使CRISPR系統(tǒng)成為了遺傳研究領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)[10]。2015年，張峰研究組又發(fā)現(xiàn)了2種可在人體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目的片段的插入和缺失的蛋白即AsCpf1和LbCpf1[11]。目前，研究者們發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)在動(dòng)物品種改良及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力[12]。【本研究的切入點(diǎn)】本研究探索利用慢病毒能有效的將CRISPR-Cpf1系統(tǒng)中LbCpf1和AsCpf1蛋白整合到293 T和HT 1080細(xì)胞基因組中，通過(guò)抗性篩選以及熒光標(biāo)記篩選得到穩(wěn)定表達(dá)LbCpf1和AsCpf1蛋白的細(xì)胞系，對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)DNA、RNA水平鑒定，并通過(guò)DNA特異性和T7E1酶切驗(yàn)證基因敲除效率?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】希望能夠通過(guò)該技術(shù)在人的腎細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)致病基因的敲除，從而對(duì)基因治療的效果起到一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司(中國(guó))，Top10感受態(tài)細(xì)胞由金維智生物科技有限公司保存。293T 細(xì)胞、293FT 細(xì)胞及HT 1080細(xì)胞，psPAX2、pMD2.G和Cas9 in pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro均由金維智生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建和包裝 根據(jù)AsCpf1、LbCpf1基因編碼序列基因編碼序列各設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出片段LbCpf1-1A，LbCpf1-1B，AsCpf1-1A和AsCpf1-1B。擴(kuò)增條件為：96 ℃，預(yù)變性3 min；95 ℃，變性25 s，Tm為61 ℃ 25 s，↓0.2 ℃/C，退火25 s，72 ℃延伸1 min 20 s；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30；72 ℃再延伸2 min，取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行跑膠檢測(cè)回收。將回收產(chǎn)物用BamH I(FD)和NotI(FD)酶切后連接至CMV-GFP-P2A-Puro(BamH I/NotI)載體，轉(zhuǎn)化至top 10/top 10 F感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定(表1)。

培養(yǎng)至第三代的6皿293FT細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70 %時(shí)可進(jìn)行三質(zhì)粒病毒包裝(轉(zhuǎn)染)實(shí)驗(yàn)，在此之前曾經(jīng)做過(guò)轉(zhuǎn)染試劑PEI與Fugen轉(zhuǎn)染效率的對(duì)比，結(jié)果可得PEI轉(zhuǎn)染效率高于Fugen,構(gòu)建的重組質(zhì)粒與PSPAX2、PMD2G 3種質(zhì)粒之比為1∶2∶0.4；總質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑之比為1∶3。室溫靜止15 min后，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換為新的10 % FBS DMEM，混勻后的溶液孵育15 min，后將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，逐滴加入已靜置完的混合液各500 μl，輕輕晃動(dòng)致混勻，培養(yǎng)48 h后收集包含病毒的細(xì)胞上清，顯微鏡下觀察熒光亮度。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞篩選 將293T細(xì)胞放置顯微鏡下觀察，細(xì)胞總體數(shù)量75 %以上，進(jìn)行6孔板分裝操作，培養(yǎng)細(xì)胞至第三或第四代時(shí)，將其傳至6孔板中。用Cas9病毒進(jìn)行2種梯度20 μl與40 μl感染，期間加入聚凝胺提高Cas9病毒感染293T細(xì)胞的效率，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況。效果較好繼續(xù)進(jìn)行96孔板分裝實(shí)驗(yàn)，將1孔生長(zhǎng)120 h后細(xì)胞胞放置顯微鏡下觀察，在顯微鏡下數(shù)清楚每16格中細(xì)胞的數(shù)量。按照1∶5的比例，總共96孔所需293T細(xì)胞液5 mL，總共分裝4個(gè)96孔板所需細(xì)胞液20 μl，其余培養(yǎng)基為40 mL，并加入120 μl嘌呤，分成4管混勻。96孔板容量為500 μl，將細(xì)胞液與培養(yǎng)基(20 % FBS)，嘌呤混勻，進(jìn)行分裝置96孔板中。放入5 % CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天后從96孔板擴(kuò)大培養(yǎng)至24孔板、6孔板、T25瓶甚至10 cm培養(yǎng)皿。

表1 引物序列

圖1 Lbcpf1片段PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 Lbcpf1、AsCpf1片段 PCR擴(kuò)增電泳圖

1.2.3 單克隆細(xì)胞的基因組及反轉(zhuǎn)錄鑒定 將挑選出的Cpf1-239T單克隆細(xì)胞提取基因組，并用其產(chǎn)物進(jìn)行DNA特異性擴(kuò)增，驗(yàn)證Cpf1基因是否成功整合進(jìn)239T細(xì)胞中。將挑選出的Cpf1-239T單克隆細(xì)胞用哺乳動(dòng)物RNA抽提試劑盒提取RNA后進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用PCR擴(kuò)增CAS9基因，擴(kuò)增條件為：98 ℃，預(yù)變性5 min；98 ℃，變性30 s，Tm為60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30；72 ℃再延伸2 min；取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 sgRNA轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞驗(yàn)證基因編輯效率 以三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette, ABC)超家族中的一個(gè)成員ABCG1基因?yàn)槟康幕?，在蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS區(qū))第2個(gè)外顯子設(shè)計(jì)sgRNA并交由金唯智生物科技有限公司合成。將成功驗(yàn)證的單克隆細(xì)胞分裝至6孔板中培養(yǎng)，并將設(shè)計(jì)的sgRNA轉(zhuǎn)染于單克隆細(xì)胞中，每孔轉(zhuǎn)入4 μg質(zhì)粒sgRNA，轉(zhuǎn)染數(shù)天后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞紅光效率情況，并提取基因組，用其產(chǎn)物與引物ABCG1-Exon2 Fn/Rn進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行7E I酶切，37 ℃，30 min后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

Lane 1～4：均為載體酶切產(chǎn)物；M為5 kb ladder

2 結(jié)果與分析

2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建

LbCpf1-1A的理論值為1.9 Kb，由圖1可知，4條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小均在1.5～2 Kb左右與其理論值基本一致，可判斷目的基因擴(kuò)增成功；圖2中LbCpf1-1B、AsCpf1-1A和AsCpf1-1B的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小均在1.5～2 Kb左右，與其理論值1.9 和2.1 Kb基本一致，可判斷目的基因擴(kuò)增成功。利用BamH I/NotI酶酶切目的載體CMV-GFP-P2A-Puro，由圖3可知，圖中酶切產(chǎn)物條帶大小在9 Kb左右與理論值9 Kb一致，可判斷質(zhì)粒構(gòu)建成功。將涂布37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的平板挑白斑進(jìn)行PCR菌檢反應(yīng)，并將菌檢正確菌液送測(cè)后發(fā)現(xiàn)測(cè)序正確。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞篩選

2.2.1 慢病毒包裝熒光檢測(cè) 圖4 a為陰性對(duì)照即無(wú)構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒包裝轉(zhuǎn)染圖，圖b為Cpf1-pLent慢病毒三質(zhì)粒包裝轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞48 h后熒光圖，由圖可知，陰性對(duì)照無(wú)熒光，可判斷慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)成功。

圖4 Cpf1-pLent轉(zhuǎn)染對(duì)比圖

圖5 Cpf1-pLent病毒滴度檢測(cè)圖

A：AsCpf1-293T細(xì)胞熒光圖；B：AsCpf1-HT 1080細(xì)胞熒光圖；C：LbCpf1-293T細(xì)胞熒光圖；D：LbCpf1-HT1080細(xì)胞熒光圖

2.2.2 病毒滴度檢測(cè)圖 圖5為慢病毒對(duì)HT 1080細(xì)胞進(jìn)行的梯度感染實(shí)驗(yàn)，根據(jù)圖中細(xì)胞熒光的亮度可初步判斷病毒的滴度在106TU/mL之上，病毒滴度較高。

2.2.3 單克隆細(xì)胞系篩選 ①6孔板細(xì)胞病毒感染。圖6為用AsCpf1-pLent、Lbcpf1-pLent病毒感染培養(yǎng)120 h之后的6孔板細(xì)胞，由圖可知細(xì)胞生長(zhǎng)良好，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent病毒感染的293 T細(xì)胞感染效率較高，后面對(duì)這2種細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的加藥單克隆細(xì)胞篩選。②96孔單克隆細(xì)胞。圖7為L(zhǎng)bCpf1、AsCpf1病毒感染后的6孔板細(xì)胞加藥(Puro)分的96孔板單克隆細(xì)胞，由圖7可知，此次初篩的單克隆細(xì)胞較為單一，轉(zhuǎn)染效率較高，為了進(jìn)一步確定其是否為單細(xì)胞及其轉(zhuǎn)染效率，后面對(duì)其進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證。

2.2.4 AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因組驗(yàn)證 用特異性引物對(duì)AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因進(jìn)行擴(kuò)增，由圖8可知，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因能被特異性引物擴(kuò)增且條帶與目的條帶一致，這初步表明AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因成功被細(xì)胞表達(dá)。

A：sCpf1-293T-7D白光圖；B：AsCpf1-293T-7D熒光圖；C：AsCpf1-HT1080 02-3B白光圖；D：AsCpf1-HT1080 02-3B熒光圖；E：LbCpf1-293T-01-7G白光圖；F：LbCpf1-293T-01-7G熒光圖；G：LbCpf1-HT1080-01-3B白光圖；H：LbCpf1-HT1080-01-3B熒光圖

Lane 1、Lane 2：以LbCpf1-293 T-01-7G細(xì)胞DNA和原質(zhì)粒LbCpf1-pLent為模板用LbCpf1-2F/2R引物擴(kuò)增的檢測(cè)條帶；Lane 3、Lane 4、Lane 5：以AsCpf1-HT1080 02-3B細(xì)胞DNA和AsCpf1-293 T-7D細(xì)胞DNA及原質(zhì)粒AsCpf1為模板用AsCpf1-2F/2R引物擴(kuò)增的檢測(cè)條帶；Lane 6：以H2O(對(duì)照)為模板用任意F/R引物擴(kuò)增的檢測(cè)條帶

2.2.5 AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因反轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證 用反轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)一步驗(yàn)證AsCpf1、LbCpf1基因有無(wú)被表達(dá)，由圖9可知，AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent cDNA能被特異性引物擴(kuò)增且條帶為300 bp左右與目的條帶一致，這表明AsCpf1-pLent、LbCpf1-pLent基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生編輯即含AsCpf1、LbCpf1基因的293 T和HT 1080單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.2.6 T7E I酶切驗(yàn)證 利用ABCG1-Exon2 F/R作為引物擴(kuò)增所抽提的Cpf1-sgRNA細(xì)胞的基因組，此時(shí)無(wú)法正確結(jié)合部分會(huì)凸起，T7E I酶切便可看出明顯掉帶，判斷出其整合最好的單克隆系。由圖10可見(jiàn)，AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B在T7E I的酶切后掉下的條帶清晰，LbCpf1-293 T-01-7G無(wú)明顯掉帶，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)中篩選出的AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B是最優(yōu)單克隆細(xì)胞系。

Lane 1、Lane 2：以LbCpf1-293T-01-7G細(xì)胞cDNA和293 T(對(duì)照)cDNA為模板用LbCpf1-2F/2R引物擴(kuò)增的檢測(cè)條帶；Lane 3、Lane 4：分別以AsCpf1-HT1080 02-3B細(xì)胞cDNA和HT1080(對(duì)照)cDNA為模板用AsCpf1-2F/2R引物擴(kuò)增的檢測(cè)條帶

Lane1：AsCpf1-293 T-7D產(chǎn)物+H2O；Lane2：AsCpf1-293 T-7D產(chǎn)物+T7E1酶；Lane3：AsCpf1-HT1080 02-3B產(chǎn)物+H2O；Lane4：AsCpf1-HT1080 02-3B產(chǎn)物+T7E1酶；Lane5：LbCpf1-293 T-01-7G產(chǎn)物+H2O；Lane6：LbCpf1-293 T-01-7G產(chǎn)物+7E1酶；Lane M：Marker DS5000

3 討論與結(jié)論

慢病毒是目前常用的構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的一種方法，比起用質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作較為復(fù)雜，但是慢病毒能將外源基因有效穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體中，所以該方法效率高，而且篩選出的單克隆基本沒(méi)有假陽(yáng)性[13-17]。本研究正是利用慢病毒能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因高表達(dá)的特點(diǎn)，首先構(gòu)建含Cpf1基因和具有Puro抗性的慢病毒載體，通過(guò)慢病毒包裝(三質(zhì)粒系統(tǒng))的方式轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞，48 h后，通過(guò)收集、濃縮和純化細(xì)胞上清得到高低度的病毒，再用病毒感染293 T和HT 1080細(xì)胞，通過(guò)嘌呤抗性和熒光標(biāo)記篩選得到Cpf1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，構(gòu)建了含Cpf1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。該細(xì)胞系理論上可直接用于任意目的基因的敲除，研究人員只需根據(jù)細(xì)胞靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA轉(zhuǎn)染至Cpf1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，效應(yīng)蛋白便會(huì)識(shí)別sgRNA位點(diǎn)并進(jìn)行切割從而達(dá)到細(xì)胞系目的基因敲除的目的。本文還對(duì)構(gòu)建好的Cpf1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，靶基因選擇了三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette, ABC)超家族的1個(gè)成員ABCG1基因，用設(shè)計(jì)好的針對(duì)ABCG1基因的sgRNA轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞，通過(guò)DNA特異性和T7E1酶切驗(yàn)證基因敲除效率，表明慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)Cpf1的293T和HT 1080細(xì)胞系各1個(gè)。