大連典型浴場(chǎng)海水中糞源指示細(xì)菌和土著病原弧菌的流行分布

明紅霞， 張穎雪,2， 金 媛， 蘇 潔， 石 巖,2， 樊景鳳

(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心， 大連 116023； 2. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 大連 116023)

弧菌屬是海洋環(huán)境中的土著微生物，在目前發(fā)現(xiàn)的30余種弧菌中,至少有12種對(duì)人類具有致病性，常引起嚴(yán)重腹瀉和脫水。其中，創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌是最常見的弧菌病的病原[1]，而霍亂弧菌作為人類霍亂的病原體能引起世界性大流行，每年約有286萬感染病例，死亡人數(shù)達(dá)9.5萬[2]。由于氣候變化的影響，弧菌在環(huán)境中的存活條件發(fā)生了改變，導(dǎo)致其分布范圍擴(kuò)大，致病性增強(qiáng)[3]。

海水浴場(chǎng)作為重要的公共場(chǎng)所，近20年來弧菌疾病暴發(fā)案例顯著增加[4]。因此，保護(hù)公眾因暴露于被污染的娛樂用水而導(dǎo)致弧菌感染至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的娛樂用水微生物評(píng)價(jià)指標(biāo)——糞便污染指示細(xì)菌(FIB)并不能保護(hù)免受因弧菌感染導(dǎo)致的人體健康威脅[5-7]，主要原因是弧菌為海洋土著細(xì)菌，其濃度及其發(fā)病率主要受環(huán)境條件控制，而與外源糞便污染無關(guān)，這些環(huán)境條件也可能是導(dǎo)致弧菌病具有地域性或季節(jié)性[8]。到目前為止，其主要的環(huán)境影響因子尚不清楚[9]。因此，為更好保護(hù)公眾健康，本研究擬在開展海水浴場(chǎng)腸球菌評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，以3種常見的病原弧菌為研究對(duì)象，分析其毒力基因標(biāo)志物的污染情況，同時(shí)對(duì)其主要環(huán)境影響因子進(jìn)行探討，以期為海水浴場(chǎng)疾病防控提供參考資料。

表1大連星海浴場(chǎng)和付家莊浴場(chǎng)采樣站位信息

1 材料與方法

1.1 采樣站信息及取樣方法

大連星海浴場(chǎng)和付家莊浴場(chǎng)為大連市內(nèi)2個(gè)典型的海水浴場(chǎng)，日均客流量分別達(dá)4萬和2萬人，旅游高峰期可達(dá)5萬～6萬人，浴場(chǎng)衛(wèi)生狀況對(duì)游客至關(guān)重要。本研究選取這2個(gè)浴場(chǎng)為研究區(qū)域，按照平均布設(shè)且兼顧游泳人群密集區(qū)的原則，在距離岸邊約20 m的斷面，每隔50～100 m布設(shè)站位(表1)，于8月份至9月份游泳高峰季節(jié)，每逢周末或降雨后12 h內(nèi)采集表層海水，星海浴場(chǎng)第一年布設(shè)5個(gè)站位，第二年布設(shè)9個(gè)站位(采集2年)，付家莊浴場(chǎng)布設(shè)6個(gè)站位(采集1年)，共采集134個(gè)海水樣品。每個(gè)站位采集表層海水3.5 L至無菌采樣桶中，冷藏保存，并于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采樣同時(shí)記錄天氣狀況，并現(xiàn)場(chǎng)用YSI測(cè)定水溫、鹽度等環(huán)境因子。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌計(jì)數(shù)

參照ISO標(biāo)準(zhǔn)[10]中濾膜法檢測(cè)海水中的腸球菌，用0.45 μm孔徑的混合纖維素濾膜過濾100 mL水樣，將濾膜貼于含疊氮鈉的培養(yǎng)基上，于(36±2)℃培養(yǎng)(44±4) h，如果觀察到紅色、栗色或粉紅色菌落，則用消毒的鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至膽鹽-七葉苷-疊氮化物培養(yǎng)基上，于(44±0.5)℃培養(yǎng)2 h，觀察并記錄棕色或黑色菌落，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.2 海水浴場(chǎng)中3種典型弧菌的毒力基因標(biāo)志物分析

樣品處理：分別取1 L混勻樣品用0.22 μm孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

DNA提?。河脽o菌剪刀把濾膜剪碎，采用Qiagen 強(qiáng)力土壤提取試劑盒(DNeasy power soil kit)提取細(xì)菌DNA，具體操作參照試劑盒說明書。

引物設(shè)計(jì)：分別根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因hlyA、trh和vvh設(shè)計(jì)引物，分析其毒力基因標(biāo)志物的污染情況，引物信息、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照郭建麗[11]和石巖[12]的研究。

結(jié)果確認(rèn)：經(jīng)PCR反應(yīng)后，用2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，如果確定反應(yīng)為陽性，則進(jìn)行克隆測(cè)序，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序確認(rèn)，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行檢索和同源性比較。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

為進(jìn)一步分析糞便污染指示細(xì)菌腸球菌與3種病原弧菌、以及各細(xì)菌學(xué)指標(biāo)與主要影響因子之間的關(guān)系，采用SPSS(V20.0)進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 天氣狀況

采樣期間記錄了天氣狀況，風(fēng)速范圍為0.3～7.9 m/s，風(fēng)級(jí)為1～4級(jí)，氣溫為19.1 ℃～28.6 ℃，浪高為0.2～1.0 m，共記錄了5次降雨，結(jié)果詳見表2。

2.2 腸球菌的分布

經(jīng)分析，在所采集的134份樣品中，大連付家莊浴場(chǎng)和星海浴場(chǎng)腸球菌的濃度在0.3～12 000 CFU/100 mL之間，其中，付家莊浴場(chǎng)海水中其濃度范圍為3.3～5433 CFU/100 mL，平均濃度為997 CFU/100 mL，星海浴場(chǎng)海水中其濃度范圍為0.3～12 000 CFU/100 mL之間，平均濃度為1136 CFU/100 mL。根據(jù)美國(guó)環(huán)保署現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[13](腸球菌的濃度≤104 CFU/100 mL)，大連付家莊浴場(chǎng)和星海浴場(chǎng)腸球菌的超標(biāo)率分別為66.7%(n=30)和55.8%(n=104)。

表2 采樣期間天氣狀況

本研究在付家莊浴場(chǎng)共采集5批次樣品，星海浴場(chǎng)共采集16批次樣品，其腸球菌分布詳見圖1和2。付家莊浴場(chǎng)降雨后(n=1)腸球菌平均濃度達(dá)3717 CFU/100 mL，而降雨前2 d其平均濃度為131 CFU/100 mL，降雨后星海浴場(chǎng)腸球菌平均濃度為2298 CFU/100 mL(n=4)，而降雨前2～3 d其平均濃度為53 CFU/100 mL。與晴天相比，降雨后(12 h內(nèi))腸球菌濃度顯著升高(P<0.01)。星海浴場(chǎng)第3次采樣前天夜里發(fā)生較大范圍降雨(28 mm)，腸球菌濃度顯著升高，雖然第4次采樣前一天有小范圍降雨(10 mm)，但因與第3次采樣只有2 d間隔，腸球菌濃度并未繼續(xù)升高，相比而言，第5次采集的漲潮時(shí)樣品中腸球菌濃度反而較高，該情況與第8次采樣結(jié)果類似。

2.3 3種病原弧菌毒力基因標(biāo)志物的分布

兩個(gè)典型海水浴場(chǎng)中副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因陽性檢出率為分別為24.6%、4.5%和10.4%，各浴場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果詳見表3。3種弧菌的毒力基因在降雨前后無顯著差異，同一浴場(chǎng)不同站位之間分布也無顯著差異。其中，副溶血弧菌在兩個(gè)浴場(chǎng)所有站位均有檢出；除個(gè)別站位(F2、F5、F6、X9)外，創(chuàng)傷弧菌在兩個(gè)浴場(chǎng)其余站位也均有檢出；除個(gè)別站位(F6)外，付家莊浴場(chǎng)在其余5個(gè)站位均有霍亂弧菌檢出，但是該病原菌在星海浴場(chǎng)各站位均未檢出。

圖1 大連付家莊浴場(chǎng)各采樣站位腸球菌的分布

2.4 指示細(xì)菌與3種病原弧菌的關(guān)系

分析數(shù)據(jù)表明，在134個(gè)樣品中，有78個(gè)樣品腸球菌超標(biāo)，其中有18個(gè)樣品檢出了副溶血弧菌毒力基因，占副溶血弧菌陽性檢出率的54.5%(18/33)；有4個(gè)樣品為創(chuàng)傷弧菌陽性，占創(chuàng)傷弧菌陽性檢出率的28.6%(4/14)；有3個(gè)樣品為霍亂弧菌陽性，占霍亂弧菌陽性檢出率的50%(3/6)。

表3 大連付家莊浴場(chǎng)和星海浴場(chǎng)表層海水中 弧菌毒力基因標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

圖2 大連星海浴場(chǎng)各采樣站位腸球菌的分布

Figure 2 Distribution of enterococci at each sampling site in Xinghai bathing beach

SPSS相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，腸球菌與創(chuàng)傷弧菌呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與副溶血弧菌和霍亂弧菌無相關(guān)性，而這兩種弧菌則呈顯著正相關(guān)關(guān)系。由此可見，腸球菌與3種病原弧菌的生態(tài)特征差異較大。而在3種弧菌中，副溶血弧菌與霍亂弧菌生態(tài)特征較為相近。

表4 Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)細(xì)菌學(xué)指標(biāo)之間以及其與環(huán)境因子的相關(guān)性

注：對(duì)霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、腸球菌等生物學(xué)指標(biāo)以及降雨量、水溫、pH值、鹽度、透明度、濁度、葉綠素a、DO等指標(biāo)進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，其中“*”代表相關(guān)，“**”代表顯著相關(guān)

2.5 主要環(huán)境、氣象影響因素的篩選

選取水溫、pH值、鹽度、透明度、濁度、葉綠素a、DO、潮汐、風(fēng)速、風(fēng)向、降雨量等指標(biāo)，采用SPSS(V20.0)進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，分析了細(xì)菌學(xué)指標(biāo)的主要環(huán)境、氣象影響因素。結(jié)果表明(表4)，腸球菌與風(fēng)速、浪高、降雨量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與DO、pH值、透明度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。副溶血弧菌與浪高呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與pH值呈正相關(guān)關(guān)系，創(chuàng)傷弧菌與鹽度、透明度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與水溫、氣溫呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。而本研究中霍亂弧菌與所測(cè)環(huán)境因子均無相關(guān)性。通過細(xì)菌學(xué)指標(biāo)與環(huán)境、氣象要素相關(guān)性分析進(jìn)一步證明，腸球菌與3種弧菌的生態(tài)學(xué)差異較大，不能用腸球菌來指示3種弧菌的污染。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外海洋娛樂用水標(biāo)準(zhǔn)均采用糞大腸菌群、腸球菌等指示細(xì)菌來保護(hù)公眾暴露于糞源病原細(xì)菌的安全[13-15]，然而，海洋土著微生物在娛樂安全用水中同樣發(fā)揮著重要的作用。我國(guó)對(duì)病原弧菌的關(guān)注主要集中在臨床、養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖水體中[16-18]，因缺少相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查和臨床數(shù)據(jù)分析，海水浴場(chǎng)中病原弧菌的感染風(fēng)險(xiǎn)尚未引起足夠的重視，目前僅見雷鎧璐等人對(duì)青島第一和第六海水浴場(chǎng)中的副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行了分析[19]，王若純等人對(duì)青島沿海淺水中溶藻弧菌的分布研究[20]，但均基于選擇性培養(yǎng)基對(duì)弧菌的篩選，雖然已結(jié)合生理生化鑒定，但是并不能確定其致病性。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)根據(jù)毒力基因來研究環(huán)境中病原弧菌的分布特征[21]。本研究顯示，在大連付家莊浴場(chǎng)和星海浴場(chǎng)中副溶血弧菌的毒力基因檢出率最高(24.6%)，其次是創(chuàng)傷弧菌，檢出率最低的是霍亂弧菌。副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因在大連兩個(gè)海水浴場(chǎng)中的分布差異不大，而霍亂弧菌只在付家莊浴場(chǎng)檢出。不同的弧菌地理分布差異較大，可能與鹽度、溫度、營(yíng)養(yǎng)成分以及或原生動(dòng)物捕獲等因素有關(guān)[22-23]，同時(shí)與采樣當(dāng)時(shí)的天氣現(xiàn)象，如浪高、風(fēng)速等有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示不同弧菌的主要環(huán)境影響因子也不相同，進(jìn)一步導(dǎo)致其生態(tài)學(xué)分布特征的差異。

研究表明，創(chuàng)傷弧菌是最危險(xiǎn)的弧菌病原，其感染后死亡率可高達(dá)20%～25%，如果感染過程伴有敗血癥，其死亡率可高達(dá)60%[24]。霍亂弧菌(non O1/O139)是第二大危險(xiǎn)弧菌病原，雖然其死亡率較低，但在高危人群中，死亡率會(huì)顯著增加——尤其是老人、肝病患者和免疫系統(tǒng)受損者[25]。與上述兩種弧菌相比，副溶血弧菌造成的死亡人數(shù)最少，在娛樂用水中常導(dǎo)致傷口和耳朵感染[26]。本研究通過檢測(cè)弧菌毒力基因標(biāo)志物，證明3種弧菌在大連代表海水浴場(chǎng)中均有潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，目前僅用糞便污染指示細(xì)菌來評(píng)價(jià)浴場(chǎng)水質(zhì)安全狀況難以保證公眾安全，亟須開展常見病原弧菌的毒力基因標(biāo)志物分析。此外，我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)對(duì)弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作還停留在食品安全領(lǐng)域[27]，尚無適用于海水浴場(chǎng)常見弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型[28]，因此未來亟須加強(qiáng)該領(lǐng)域的研究，實(shí)現(xiàn)弧菌的人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，預(yù)防和減少相關(guān)疾病的發(fā)生。