藏羊心臟傳導(dǎo)系結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)研究

張 晨，劉斯汝，王宣敬，蔡 勇，羅 慧，何雨珊，王翻兄，羅文學(xué)，扎西英派，阿依木古麗

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，蘭州 730030；3.天祝藏族自治縣畜牧技術(shù)推廣站，甘肅武威 733200)

高原地區(qū)由于明顯的低氧環(huán)境[1]，許多動(dòng)物難以生存。藏羊有很強(qiáng)的高原低氧適應(yīng)能力，是中國(guó)西部高原地區(qū)特有的綿羊品種，也是青藏高原地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)畜種[2]。Heat等[3]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物進(jìn)入高原地區(qū)后，由于低壓低氧的刺激，反射性地引起肺動(dòng)脈高壓，持續(xù)高原低氧刺激則可導(dǎo)致高原性心臟病或高地病(Brisket disease)。俞紅賢[4]研究也發(fā)現(xiàn)高原適應(yīng)很大程度上取決于動(dòng)物肺臟的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有學(xué)者報(bào)道[5]，急進(jìn)高原地區(qū)人群的Tei(Tei index心肌做功)指數(shù)顯著增高，LVEF(左室射血分?jǐn)?shù))和LVFS(左室收縮末內(nèi)徑)則顯著降低，表明高原低氧環(huán)境也影響心臟搏動(dòng)能力。在正常心動(dòng)周期中，竇房結(jié)(Sinoatrial node，SAN)為心臟搏動(dòng)提供竇性心律，當(dāng)竇房結(jié)功能失效時(shí)(如斯氏第一結(jié)扎)則由房室結(jié)(Atrioentricul node，AVN)提供起搏點(diǎn)[6]，房室束(Hisbundle，HB)為心臟搏動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的干束，浦肯野纖維(Purkinje)為信號(hào)傳導(dǎo)支束，4個(gè)結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)(Cardiac conduction system，CCS)[7]。目前心臟傳導(dǎo)系在綿羊[8]、犬[9]、兔[10]、人[11]、駱駝[12]、牛[13]和牦牛[14]等均有研究。藏羊是高原牧區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，目前有關(guān)藏羊心臟傳導(dǎo)系的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)未見相關(guān)報(bào)道。因此，本文擬研究藏羊心臟傳導(dǎo)系的結(jié)構(gòu)特征，為藏羊高原適應(yīng)的解剖學(xué)特性提供基礎(chǔ)理論，為低氧低壓時(shí)心臟傳導(dǎo)系的適應(yīng)機(jī)制研究提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與采樣

1歲左右健康藏羊10只，來(lái)自青海主月畜牧業(yè)屠宰場(chǎng)。羊只斷頸放血致死，檢查胸腹腔可視病理變化，分離完整心臟，排出心腔積血，生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定24 h，采用Davies檢查法[15]采集竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束和浦肯野纖維，置換固定液復(fù)固定，備用。

1.2 染色

1.2.1 石蠟切片制作 組織固定72 h后，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，連續(xù)切片，厚度5 μm。

1.2.2 Delafield氏蘇木精—伊紅(HE)染色 按照常規(guī)HE染色法進(jìn)行。

1.2.3 PTAH磷鎢酸蘇木素法 切片脫蠟復(fù)水后，氧化液中孵育5 min，漂白液中漂白5 min，5%硫酸鐵銨孵育5 min，磷鎢酸蘇木素 56 ℃染色1 h，95%酒精分化后脫水透明，中性樹膠封片。心肌橫紋閏盤和心神經(jīng)呈黑色。

1.2.4 Masson三色染色法 切片脫蠟復(fù)水后，Regand蘇木精孵育15 min，Masson 麗春紅復(fù)紅液孵育10 min，1%磷鉬酸分化，苯胺藍(lán)染色 5 min，0.2%冰醋酸浸洗，95%酒精分化后脫水透明，中性樹膠封片。心肌纖維和神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，彈性纖維呈淺紅色，細(xì)胞核呈黑色。

1.2.5 復(fù)方碘涂抹法 5%復(fù)方碘液與左右心內(nèi)膜反復(fù)涂抹，數(shù)秒后Purkinje纖維可呈黑色，黑色僅維持5 min左右，反復(fù)顯色4次。

1.3 測(cè)量與計(jì)算

游標(biāo)卡尺測(cè)量每只羊竇房結(jié)長(zhǎng)度、寬度和厚度，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其余數(shù)據(jù)采用Image Proplus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)組織隨機(jī)取5張切片，每張切片400倍視野隨機(jī)取10個(gè)不同區(qū)域，用Image Proplus 6.0觀察并測(cè)量。HE染色切片中測(cè)量竇房結(jié)與房室結(jié)的長(zhǎng)度、寬度和厚度，測(cè)量房室束與Purkiinje的纖維直徑；測(cè)得數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏羊CCS解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由圖 1 可以看出，藏羊竇房結(jié)位于前腔靜脈與右心耳交界處，沿心臟冠狀切面方向分布，新鮮組織中的形態(tài)肉眼可辨，心外膜和心內(nèi)膜均可見，心內(nèi)膜表面更清晰，為前端寬，后端窄的乳白色長(zhǎng)索狀，其大小與心臟的體積相關(guān)，其余CCS組織肉眼無(wú)法辨認(rèn)。

a.右心房(心內(nèi)膜側(cè)) Right atrium(endocardial side); ↑↓.竇房結(jié) Sinoatrial node;RE.右心耳 The right atrium;b.左心室 Left ventricle;HB.房室束 Hisbundle; LHB.左房室束 Left hisbundle;AP.Purkinje前群 Purkinje anterior group; MP.Purkinje中間群 Purkinje intermediate group; PP.Purkinje后群 Purkinje posterior group

圖1 藏羊心臟傳導(dǎo)系分布圖
Fig.1 Anatomical characteristics of Tibetan sheep cardiac conduction system

2.2 組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 竇房結(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu) 藏羊竇房結(jié)橫切面呈長(zhǎng)條狀，周邊由普通心肌纖維圍繞，界限清晰，竇房結(jié)組織主要由起搏細(xì)胞(P細(xì)胞)和過(guò)渡細(xì)胞(T細(xì)胞)組成，著色較普通心肌纖維淺；竇房結(jié)中有一條微動(dòng)脈和一條微靜脈貫穿(圖2-a)。Masson染色顯示，P細(xì)胞和T細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色，較普通心肌纖維更細(xì)小，細(xì)胞間有大量膠原纖維分布(圖2-b)，經(jīng)PTAH染色后，普通心肌細(xì)胞可見明顯的橫紋，竇房結(jié)組織中T細(xì)胞可見較為清晰的橫紋，P細(xì)胞中觀察不到橫紋(圖2-c，圖2-d)。

2.2.2 房室結(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu) 藏羊房室結(jié)呈卵圓形，外周圍繞有致密的覆蓋層，中央有大量著色較淺的P細(xì)胞聚集成束，每束由3～5個(gè)P細(xì)胞組成(圖3-a)。P細(xì)胞間有大量藍(lán)染的膠原纖維和紅染的神經(jīng)膠質(zhì)，P細(xì)胞位于中央，著色較淺，而其周圍的普通心肌細(xì)胞著色較深(圖3-b)。PTAH染色的房室結(jié)組織中T細(xì)胞可見橫紋，P細(xì)胞中觀察不到橫紋(圖3-c)。

a.竇房結(jié)橫切面(HE × 40) SAN transection(HE×40); b. 竇房結(jié)橫切面(Masson × 40) SAN transection(Masson × 40); c.竇房結(jié)橫切面(PTAH×40) SAN transection(PTAH × 40); d.竇房結(jié)橫切面(PTAH × 400) SAN transection(PTAH×400)

←→.SAN組織與普通心肌組織分界線(左側(cè)為右心房肌,右側(cè)為前腔靜脈基部) Dividing between SAN tissue and normal myocardial tissue(right atrial muscle on the left,base of the anterior vena cava on the right); A.SAN微動(dòng)脈 An arteriole of SAN; ☆.心神經(jīng)，周邊有一薄層鞘膜 Heart nerve,a thin layer of sheath membrane around; HM.正常心肌組織 Normal myocardial tissue; SANM.竇房結(jié)組織 Sinus node tissue

圖2 藏羊竇房結(jié)組織學(xué)顯微結(jié)構(gòu)
Fig.2 Micro-structure of Tibetan sheep sinoatrial node

a.房室結(jié)橫切面(HE × 40) AVN transection(HE × 40); b.房室結(jié)橫切面(Masson × 40) AVN transection(Masson × 40); c.房室結(jié)橫切面(PTAH×40) AVN transection(PTAH×40); d.房室結(jié)橫切面(HE×400) AVN transection(HE×400); e.房室結(jié)橫切面(Masson×400) AVN transection(Masson×400); △.覆蓋層 Covering layer; ←.P細(xì)胞團(tuán)塊(3～5個(gè)P細(xì)胞) P cell mass(3-5 P cells); ☆.房室結(jié)組織間膠原纖維 AVNcollagen fiber；TC.T細(xì)胞 Transitional cell

圖3 藏羊房室結(jié)顯微結(jié)構(gòu)
Fig.3 Micro-structure of atrioventricular node of Tibetan sheep

2.2.3 房室束組織學(xué)結(jié)構(gòu) 連續(xù)切片顯示，His束為室間隔橫向的長(zhǎng)橢圓狀，組織結(jié)構(gòu)較為疏松，P細(xì)胞著色淺，其間有大量微動(dòng)脈以及彈性纖維分布(圖4-a)。His束組織PTAH染色呈陰性，表明組織中P細(xì)胞較多。His束、LHis束及RHis束間均有一微動(dòng)脈分布。

2.2.4 浦肯野纖維組織學(xué)結(jié)構(gòu) 浦肯野纖維分布于心室內(nèi)膜下層，一個(gè)浦肯野纖維斷面常有3～5個(gè)浦肯野纖維細(xì)胞組成(圖5-a)。其細(xì)胞核較小呈深藍(lán)色，胞質(zhì)較大呈淺紅色，每個(gè)細(xì)胞首尾相接構(gòu)成浦肯野纖維(圖5-b)；浦肯野纖維外有膠原纖維包裹，浦肯野細(xì)胞內(nèi)有神經(jīng)膠質(zhì)和膠原纖維分布，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，浦肯野纖維不能被PTAH染色，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，浦肯野纖維細(xì)胞間有少量毛刷狀結(jié)構(gòu)，類似閏盤的結(jié)構(gòu)將細(xì)胞分割開來(lái)。

2.3 形態(tài)學(xué)測(cè)量

2.3.1 藏羊竇房結(jié)與房室結(jié) 藏羊竇房結(jié)可通過(guò)肉眼觀察，其形態(tài)為一端較寬而薄，另一端窄而厚的長(zhǎng)條索狀，經(jīng)解剖學(xué)方法測(cè)量，其平均長(zhǎng)度(8.82±0.09) mm，平均寬度(2.50±1.24) mm，平均厚度(0.82±0.09) mm(表1)。房室結(jié)組織肉眼不可辨，經(jīng)Davies法定位后，其組織位于室間隔與房間隔的交界處，呈長(zhǎng)橢圓狀，通過(guò)顯微測(cè)量測(cè)得其平均長(zhǎng)軸為(2 392.45±231.23) μm，平均短軸(1 634.22±124.65) μm(表1)，由于技術(shù)原因，房室結(jié)厚度數(shù)據(jù)無(wú)法獲得。

a.房室束橫切面(HE×200) HB transection(HE×200); b.房室束縱切面(PTAH×40) HB Longitudinal section(PTAH×40);☆.左房室束 ;△.右房室束 RHB

圖4 藏羊房室束顯微結(jié)構(gòu)
Fig.4 Micro-structure of atrioventricular hisbundle of Tibetan sheep

a.左心室浦肯野纖維后群(HE×100) Left ventricular posterior Purkinje group(HE×100); b.右心室浦肯野纖維中間群(HE×100) Right ventricular middle Purkinje group(HE×100); c.左心室浦肯野纖維前群(Masson×400) Left ventricular anterior Purkinje group(Masson×400); d.左心室浦肯野纖維前群(PTAH×400) Left ventricular anterior Purkinje group(PTAH×400);EP.心內(nèi)膜 Endocardium; ☆.浦肯野纖維橫斷面 Purkinje cross-sectional; △.浦肯野纖維縱切面 Purkinje longitudinal section; ↑.浦肯野纖維膠原纖維鞘膜 Purkinje elastic fiber sheath; ↓.浦肯野纖維中細(xì)胞界限(毛刷狀) Cell boundaries in Purkinje(brush-like)

圖5 藏羊浦肯野纖維顯微結(jié)構(gòu)
Fig.5 Micro-structure of Tibetan sheep purkinje cell

表1 藏羊SAN與AVN形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果Table 1 SAN and AVN morphological measurement results of Tibetan sheep

注：“N/A”表示數(shù)據(jù)結(jié)果無(wú)法獲得。

Note:“N/A” in the table indicates that data results unable to get.

2.3.2 藏羊房室束 藏羊房室束為房室節(jié)的延續(xù)部分，位于室間隔深部，中央纖維環(huán)正下方，其橫斷面為偏圓的橢圓形，平均直徑為(868.21±136.44) μm(表2)，His束結(jié)構(gòu)整體偏向左心方向，自上端向下約1 cm處分為兩支，其中左支直徑為(372.34±13.60) μm，右支直徑為(318.44±11.52) μm，兩者間差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 藏羊浦肯野纖維 藏羊浦肯野纖維由左右支束延續(xù)，在左右心室內(nèi)膜表面分為3 個(gè)群體(表3)，各個(gè)群體的浦肯野纖維直徑中，左心室均較右心室大，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。同側(cè)心室中，后群浦肯野纖維直徑最大，中群次之，前群最小，且各群之間差異顯著 (P<0.05)。

3 討 論

李鳳霞[16]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊竇房結(jié)外觀呈現(xiàn)上寬下窄的S形。本研究結(jié)果顯示，藏羊竇房結(jié)為頭部較寬，尾部較窄的白色長(zhǎng)索狀，位于前腔靜脈與右心耳交界處。Romero等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，山羊竇房結(jié)為跨膜型結(jié)構(gòu)，心內(nèi)膜和心外膜均可辨。藏羊同山羊一樣，竇房結(jié)心內(nèi)膜和心外膜均肉眼可辨，內(nèi)膜側(cè)相對(duì)清晰。而Copenhaver等[18]發(fā)現(xiàn)人類竇房結(jié)組織則只能從心內(nèi)膜側(cè)辨識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，藏羊竇房結(jié)長(zhǎng)、寬、厚較綿羊大[18]。有學(xué)者認(rèn)為，竇房結(jié)大小與心臟體積成正比，如在人類[19]、豬[20]和犬[9]等均有此現(xiàn)象，但也有部分學(xué)者[21]表示，竇房結(jié)大小與心臟體積并無(wú)明顯比例關(guān)系。而本研究結(jié)果顯示，藏羊心臟竇房結(jié)大小與心臟體積具有一定的相關(guān)性，而在綿羊[8]并無(wú)此現(xiàn)象。藏羊竇房結(jié)內(nèi)部細(xì)胞以T細(xì)胞為主，輔以少量的P細(xì)胞，整體著色較淺，這與李鳳霞等[22]對(duì)綿羊竇房結(jié)的研究結(jié)果一致。另外，藏羊的竇房結(jié)中有微動(dòng)脈和微靜脈各一條，但有關(guān)豬[20]、綿羊[8]、人[11]、兔[10]、大鼠[23]等的報(bào)道結(jié)果中都沒有提到相同的結(jié)構(gòu)，其具體差異需要進(jìn)一步研究。

表2 His束、LHis及RHis平均直徑Table 2 The average diameter of HB,LHB and RHB μm

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different letters indicate significant difference(P<0.05).The same below.

表3 藏羊左心室右心室浦肯野纖維對(duì)比Table 3 Comparison of Purkinje fibers in left ventricle and right ventricle of Tibetan sheep μm

藏羊房室結(jié)位于室間隔與房室隔的中央，其結(jié)構(gòu)和位置與人類房室結(jié)[24]相似，而牦牛房室結(jié)則位于房間隔右側(cè)，三尖瓣上方[14]，兔子[10]與豚鼠[25]的房室結(jié)均分布于整個(gè)房間隔中。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藏羊房室結(jié)呈卵圓形且長(zhǎng)軸較長(zhǎng)，這與牦牛[14]和綿羊[8]房室結(jié)的形態(tài)一致。藏羊房室結(jié)組織內(nèi)有大量膠原纖維分布，其間有較多的P細(xì)胞和少量的T細(xì)胞，這與綿羊[18]類似，而牦牛[14]與山羊[26]的房室結(jié)中T細(xì)胞數(shù)量多于P細(xì)胞。藏羊房室結(jié)中P細(xì)胞呈團(tuán)狀分布，其外層有一薄層彈性纖維膜包裹。有研究表明這種結(jié)構(gòu)具有絕緣作用[27]，且房室結(jié)最外圍覆以較厚的覆蓋層，是心室擱延的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一[28]。藏羊房室結(jié)組織PTAH染色后光鏡下沒有觀察到橫紋或閏盤的結(jié)構(gòu)，表明房室結(jié)中正常心肌細(xì)胞與T細(xì)胞數(shù)量較少，其具體結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步研究。

His束為房室結(jié)組織的延續(xù)，位于室間隔深部[29]，肉眼不易辨別。本研究中，連續(xù)切片觀察發(fā)現(xiàn)藏羊His束呈圓柱狀，其直徑自上而下逐漸縮小，而后分為左側(cè)LHis束與右側(cè)RHis束，其中LHis束直徑顯著大于RHis束(P<0.05)，這與Duan等[14]在牦牛中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。藏羊His束其內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)散亂，P細(xì)胞數(shù)量較T細(xì)胞多，His束周圍均有一層結(jié)締組織包饒。另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藏羊His束中有豐富的毛細(xì)血管分布，LHis與RHis中央各有一條微動(dòng)脈貫穿。

復(fù)方碘液涂抹法[30]可在短時(shí)間內(nèi)顯示浦肯野纖維，本研究中藏羊浦肯野纖維在左右心腔中均有3個(gè)分支群，左側(cè)分支較右側(cè)明顯，從心內(nèi)膜表面即可辨認(rèn)，這與牦牛[14]浦肯野纖維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相似。其中前群較細(xì)，位于前乳頭肌附近；中間群由前后支吻合而成，位于室間隔附近；后群較粗，位于后乳頭肌附近，3 個(gè)群體在遠(yuǎn)端呈網(wǎng)狀吻合。此結(jié)果與Ansari等[31]在綿羊浦肯野纖維研究中的結(jié)果一致。藏羊浦肯野纖維常由3～5個(gè)浦肯野細(xì)胞組成，其間有神經(jīng)膠質(zhì)和膠原纖維分布。同房室結(jié)結(jié)構(gòu)類似，浦肯野纖維外周包裹有一薄層膠原纖維，可能也有絕緣作用。Shimada等[32]發(fā)現(xiàn)山羊心臟浦肯野纖維之間出現(xiàn)類似毛刷狀結(jié)構(gòu)，為浦肯野細(xì)胞間的一種連接方式，其功能與閏盤類似。試驗(yàn)中PTAH染色后，藏羊浦肯野纖維之間也出現(xiàn)類似毛刷狀結(jié)構(gòu)，其具體功能有待進(jìn)一步研究。