自身免疫性甲狀腺炎患者血漿中Th1/Th2細(xì)胞及甲狀腺自身抗體水平變化及臨床意義

汪 湲，康志強(qiáng)，張小芳，許玲玉

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 a.內(nèi)分泌科，b.藥學(xué)部，河南 鄭州 450007)

自身免疫性甲狀腺炎(AIT)又被稱為淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎或橋本甲狀腺炎，多與遺傳、環(huán)境、過量碘攝入、病毒感染、維生素D缺乏及吸煙等因素有關(guān)[1]，尤其好發(fā)于中年女性。由于起病隱匿性強(qiáng)，AIT早期臨床癥狀輕微或不能發(fā)現(xiàn)任何癥狀，即便通過影像學(xué)及甲功五項檢測，也較容易與其他病因引起的非炎癥性甲亢相混淆，診斷準(zhǔn)確性較低[2]。甲狀腺自身抗體檢測已成為AIT確診的必要依據(jù)[3]，但不同的免疫性疾病也可引起相關(guān)指標(biāo)變化，因此仍有待結(jié)合其他指標(biāo)加以佐證。免疫球蛋白G4(IgG4)相關(guān)性疾病是近年來備受關(guān)注的自身免疫性疾病新定義，由于該物質(zhì)能促進(jìn)淋巴漿細(xì)胞浸潤[4]，可進(jìn)攻多種臟器，導(dǎo)致病變進(jìn)程加快，已報道有腎病、硬化性膽管炎等臟器受累而預(yù)后惡化的研究[5，6]，但對IgG4相關(guān)性甲狀腺疾病的研究仍停留在臨床特點分析階段[7]，較少深入分析與檢測指標(biāo)變化之間的聯(lián)系。本研究探討相關(guān)指標(biāo)在AIT診斷及病情評估方面的檢測價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年5月至2019年4月我院收治的96例AIT患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢結(jié)果均符合AIT相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡≥18歲；③檢查結(jié)果完善且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷出合并其他甲狀腺疾患；②已執(zhí)行藥物、放療、手術(shù)等干預(yù)措施；③存在其他內(nèi)分泌、自身免疫性及全身疾病；④近期應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑；⑤妊娠期或哺乳期婦女。男11例，女85例；年齡20～59歲[(42.16±9.43)歲]；超聲下腺體體積(25.12±8.68)cm3；甲功五項促甲狀腺激素(FSH)(17.93±3.54)mU/L，游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)(2.19±0.47)pmol/L，游離甲狀腺素(FT4)(7.06±1.78)pmol/L，總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)(0.52±0.10)nmol/L，總甲狀腺素(TT4)(40.93±6.57)nmol/L。根據(jù)其血漿免疫球蛋白G4(IgG4)檢測情況分為陽性組(IgG4>1.35 g/L，n=34)與陰性組(IgG4≤1.35 g/L，n=62)[9～11]，并將同期確診的47例非炎癥性甲亢患者納入對照。

1.2 方法常規(guī)采集患者靜脈血4 ml、3 ml分別裝入抗凝管a、b，4 ℃冰箱內(nèi)保存，并在0.5 h內(nèi)開展標(biāo)本處理。

1.2.1外周血輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1、Th2細(xì)胞檢測方法 a管血樣轉(zhuǎn)入干燥離心管，加入CD4-PC5單抗，混勻后避光37 ℃溫育30 min染色，磷酸緩沖液(PBS)洗滌后以1500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上清后以吸水紙吸干；依次加入含10%胎牛血清、1%雙抗的洛斯維·帕克紀(jì)念研究所-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基、丙二醇甲醚乙酸酯(PMA)工作液、莫能霉素工作液，制備成1 ml細(xì)胞刺激培養(yǎng)體系；經(jīng)由溫育、洗滌、離心、破膜、固定、再溫育、再離心、熒光素標(biāo)記、再溫育、再離心、重懸等處理過程后，置入流式細(xì)胞管內(nèi)送Beckman Coulter流式細(xì)胞儀檢測并計算出Th1/Th2水平。

1.2.2血漿學(xué)指標(biāo)檢測方法 b管血樣轉(zhuǎn)入干燥離心管，以4500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，提取上清液作為檢測標(biāo)本適當(dāng)稀釋，預(yù)先將冷凍儲存的抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)、IgG4試劑盒放置于室溫下恢復(fù)適宜溫度；逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，加生物素化抗混勻，封膜溫育后棄去孔內(nèi)液體，洗滌并加入等體積辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素并混勻，封膜溫育；棄去孔內(nèi)液體并洗滌、拍干，加底物溶液，封膜避光溫育約15 min；立即送入全自動酶標(biāo)儀，擬合出該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品孔吸光度換算相應(yīng)物質(zhì)在血漿中的濃度水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗；建立二元Logistic回歸模型，將病種(賦值1=“AIT”、0=“非炎癥性甲亢”)、組別(賦值1=“陽性組”、0=“陰性組”)納入因變量，將相關(guān)計量指標(biāo)作為協(xié)變量，方法為Enter，設(shè)定返回概率，并將其作為聯(lián)合診斷的獨立指標(biāo)用于診斷效能評估；將診斷信息錄入Medcalc 18.2版本軟件中，選取受試者工作特征(ROC)曲線對比，分別設(shè)置變量與分類標(biāo)準(zhǔn)，選擇不同診斷條件曲線下面積(AUC)比較方法為DeLong檢驗，記錄AUC、95%CI、靈敏度、特異度、cut-off值等參數(shù)信息。檢驗水準(zhǔn)α=0.05

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)指標(biāo)診斷效能評估Th1/Th2、TGAb、TPOAb、TRAb診斷AIT的cut-off值分別為12.83、228.13 U/ml、503.63 U/ml、33.45 U/L，ROC曲線AUC均明顯小于聯(lián)合診斷(P< 0.05)，聯(lián)合診斷靈敏度為90.62%，特異度為97.87%，見圖1、表1。

圖1 Th1/Th2、TGAb、TPOAb、TRAb分別及聯(lián)合診斷AIT的ROC曲線

表1 ROC曲線相關(guān)參數(shù)

*與聯(lián)合診斷比較，P< 0.05

2.2 AIT患者與非炎癥性甲亢患者相關(guān)指標(biāo)比較

AIT患者Th1/Th2及血漿TGAb、TPOAb水平低于非炎癥性甲亢患者，血漿TRAb水平低于非炎癥性甲亢患者(P< 0.05)，見表2。

表2 AIT患者與非炎癥性甲亢患者Th1/Th2及血漿TGAb、TPOAb、TRAb水平比較

2.3 不同IgG4表達(dá)情況AIT患者相關(guān)指標(biāo)比較

兩組Th1/Th2、TRAb水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，而陽性組TGAb、TPOAb水平高于陰性組(P< 0.05)，見表3。

表3 兩組Th1/Th2及血漿TGAb、TPOAb、TRAb水平比較

2.4 相關(guān)性分析AIT患者Th1/Th2、TRAb水平與IgG4水平未見相關(guān)性(P> 0.05)，TGAb、TPOAb水平與IgG4水平呈正相關(guān)(P< 0.05)，見表4。

表4 Th1/Th2、TRAb、TGAb、TPOAb與IgG4水平的相關(guān)性分析

3 討論

Th是在特異性免疫應(yīng)答中起到主要調(diào)節(jié)作用的淋巴細(xì)胞，可分化出Th1、Th2兩種亞型，前者，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫作用，清除病原體并誘使免疫細(xì)胞浸潤，而后者主要介導(dǎo)體液免疫，清除抗原并發(fā)揮抗過敏作用，正常情況下二者相互調(diào)節(jié)可達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)，維持免疫系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)[12]。本研究中，AIT患者Th1/Th2水平顯著較非炎癥性甲亢患者更高，其水平≥12.83可高風(fēng)險提示為AIT，這表明Th1/Th2平衡向Th1漂移可誘發(fā)AIT，通過表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子強(qiáng)化其浸潤后的增殖及損傷效率。相關(guān)學(xué)者表示，Th1/Th2失衡程度與AIT病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可通過Th1細(xì)胞表面特異性標(biāo)志抗原CD4+CCR5+[13]，預(yù)測TPOAb增高幅度及疾病轉(zhuǎn)歸情況。

有關(guān)研究指出，TSAb具有類似TSH作用，與TSHR結(jié)合后，可促進(jìn)甲狀腺激素合成，引發(fā)包括格雷夫斯病在內(nèi)的非炎癥性甲亢；而TSBAb與TSHR結(jié)合后則不能激活細(xì)胞膜表面的腺苷酸環(huán)化酶，還將阻礙受體與TSH結(jié)合，抑制甲狀腺激素合成而引發(fā)甲減，二者同時存在則容易引起甲亢-甲減病情反復(fù)。本研究結(jié)果顯示，AIT患者血漿TRAb水平顯著較非炎癥性甲亢患者更低，其水平≤33.45 U/L可高風(fēng)險提示為AIT，提示臨床可通過TRAb檢測代替無法直接簡便測得的TSAb、TSBAb用以區(qū)分AIT早期甲亢與非炎癥性甲亢，為臨床提供全面診斷信息。部分專家表示，TPOAb相較于TGAb應(yīng)用于AIT診斷時更具靈敏性與特異性，尤其在AIT患者甲亢階段及經(jīng)過系統(tǒng)性治療后，其水平均可表現(xiàn)出顯著變化趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，AIT患者血漿TGAb、TPAOAb均較非炎癥性甲亢患者顯著更高，當(dāng)其水平分別高于228.13 U/ml、503.63 U/ml時可高風(fēng)險提示為AIT，這與既往研究所得出的200 U/ml、500 U/ml臨界值較為接近，且聯(lián)合檢測Th1/Th2與TRAb能進(jìn)一步明顯提高診斷效能，使靈敏度、特異度達(dá)到97.87%、90.62%，提示多個指標(biāo)聯(lián)合診斷能有效避免其他機(jī)制對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的相似影響，從而有助于減少誤診與漏診。

有關(guān)免疫生理學(xué)研究指出，AIT相關(guān)抗體蛋白均由IgG構(gòu)成，其中TGAb主要包含IgG4，而TPOAb同時含有較多IgG1與IgG4，TRAb分作TSAb、TSBAb兩種亞型，均不含有IgG4。本研究還發(fā)現(xiàn)，陽性組血漿TGAb、TPOAb水平顯著較陰性組更高，且與IgG4水平表現(xiàn)出明顯正相關(guān)性，這不僅證實上述論點，還提示臨床能通過早期監(jiān)測AIT患者TSAb、TSBAb變化情況，盡早預(yù)警并慎重對待疾病遷延可能性，為改善患者預(yù)后創(chuàng)造有利條件。Luiz等[14]認(rèn)為，IgG4相關(guān)性橋本甲狀腺炎纖維化變不同于普通橋本甲狀腺炎，是濾泡間纖維化，而并非小葉間纖維化，且由于IgG4淋巴漿細(xì)胞浸潤，其病灶濾泡細(xì)胞退化更為嚴(yán)重，累及范圍擴(kuò)大更快，甚至導(dǎo)致多個器官受累，在超聲影像中可辨別出的彌漫性蜂窩狀或網(wǎng)格狀低回聲，需引起高度重視。

綜上所述，AIT患者相較于非炎癥性甲亢患者在Th1/Th2及血漿TGAb、TPOAb、TRAb水平方面存在明顯的異常表現(xiàn)，臨床可借此實施較為準(zhǔn)確的鑒別診斷，且TGAb、TPOAb與IgG4表達(dá)情況關(guān)系尤其密切，有助于早期指導(dǎo)臨床預(yù)測、評估其病情進(jìn)展，以便提供適宜的干預(yù)措施改善患者預(yù)后。