新型抗菌肽DP7對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響探討

任 靜，青 薇，鄭佳俊，黃 杰，彭湃然，牟雁東，2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

炎癥引起的口腔疾病，如牙周炎，常常引起牙槽骨的吸收和結(jié)締組織的破壞。牙周炎是發(fā)生于牙支持組織的炎癥性感染性疾患，是口腔領(lǐng)域中兩大多發(fā)病之一，常引起牙槽骨吸收、牙松動(dòng)甚至脫落，是破壞人類(lèi)咀嚼器官的最主要疾病[1]。牙菌斑作為牙周炎發(fā)病的始動(dòng)因子，在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。牙菌斑的致病性，主要是通過(guò)菌體內(nèi)毒素、細(xì)酶及其釋放的的外毒素與細(xì)胞因子和代謝產(chǎn)物等直接破壞牙周組織，牙周致病菌的內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，由菌體崩解后釋放而出，還能夠通過(guò)細(xì)菌抗原成分活化宿主的多種防御細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、核因子受體激活劑(RANKL)等因子的釋放，引發(fā)局部的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致牙周組織的繼發(fā)性損傷[2]。

抗菌肽(antibacterial peptide，AMP)廣泛存在于真菌、細(xì)菌、昆蟲(chóng)、植物及動(dòng)物體內(nèi)，作為免疫系統(tǒng)的天然防線，對(duì)宿主抵抗外來(lái)生物入侵具有非常重要的意義[3]。此外，某些抗菌肽還具有免疫調(diào)節(jié)性能[4]，能夠趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向炎癥部位聚集，同時(shí)抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)[5]，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生，以及促進(jìn)血管形成，促進(jìn)受損區(qū)域組織愈合[6]。因此，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，抗菌肽受到越來(lái)越多的關(guān)注，有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用。本實(shí)驗(yàn)擬使用的陽(yáng)離子AMP DP7(VQWRIRVAVIRK)為四川大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)生物實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的新型12-氨基酸亞梨子親水小分子抗菌肽，已證明其具有廣譜抗菌性、較好的生物相容性[7]，在體內(nèi)外均能夠?qū)瘘S色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等產(chǎn)生良好的抑制效果，并能夠抑制LPS引起的TNF-α、IL-1β的釋放[8]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為骨組織損傷后修復(fù)的重要細(xì)胞，能夠分化為成骨細(xì)胞，進(jìn)而形成新骨[9]。若新型陽(yáng)離子抗菌肽DP7在具有良好抗菌性能的同時(shí)，能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，將為牙周炎的臨床治療開(kāi)辟新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料2019年1～5月，選擇4周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠(由四川省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重(60.4±10.2)g；DP7(VQWRIRVAVIRK)由四川大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)生物實(shí)驗(yàn)室自主合成并純化；實(shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清(FBS)、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Gibco，美國(guó))、青霉素/鏈霉素-雙抗(Sigma，美國(guó))、成骨誘導(dǎo)液(含5%胎牛血清，DMEM，10 nmol/ L地塞米松，10 mmol/ ml β-磷酸甘油鈉、50 μg/ ml L-抗壞血酸)，CCK-8試劑盒(FIUORESCENCE)，ALP試劑盒(南京建成，中國(guó))，茜素紅S(Sigma，美國(guó))等。本研究經(jīng)四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫審(研)2018年第296號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 4周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠由7%水合氯醛麻醉，消毒，切開(kāi)腿部皮膚和肌肉，鈍性分離后離斷大鼠股骨和脛骨，剪開(kāi)股骨兩端的骨骺端，配比含有青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，獲得細(xì)胞懸液。800 r/min離心5 min，棄上清，以1×106/ml的細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，此時(shí)為P0代。原代培養(yǎng)5 d后進(jìn)行全液換液，約達(dá)到80%融合時(shí)，0.25%胰酶消化，將其接種于新的培養(yǎng)皿，此時(shí)記為P1代，每3 d更換培養(yǎng)基，按照上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)至P3代備用。

1.2.2CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，已完成流式檢測(cè)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，可以納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞懸液，取1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μl，共設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12小時(shí)。分別加入DP70、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/ml，分別處理4天后，每孔加入20 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。向每孔中加入20 μl 終止液，立即混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，吸光度值與細(xì)胞的增殖能力成正比。

1.2.3細(xì)胞劃痕檢測(cè)遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后按一定細(xì)胞密度接入六孔板中。貼壁生長(zhǎng)24 h時(shí)后，融合達(dá)到80%；在盤(pán)底用記號(hào)筆畫(huà)線作為標(biāo)記，吸去培養(yǎng)液，用10 μl槍頭垂直于記號(hào)筆標(biāo)記劃去盤(pán)中細(xì)胞；用PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞，按照以上分組進(jìn)行細(xì)胞處理。在0、24、48、72 h分別拍照，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.4成骨誘導(dǎo)分化 待BMSCs生長(zhǎng)增殖至80%融合時(shí)，收集細(xì)胞懸液，取2.5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過(guò)夜；第2 d移除孔板內(nèi)原有培養(yǎng)液，換成骨誘導(dǎo)液(含5%胎牛血清，DMEM，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/mlβ-磷酸甘油鈉、50 μg/ml L-抗壞血酸)。各孔按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入0、32、48、64 mg/L DP7。后每3 d換液，至實(shí)驗(yàn)設(shè)置的時(shí)間為止。

1.2.5ALP染色 誘導(dǎo)結(jié)束后，將各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定。移除孔板內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入400 μl 4%多聚甲醛，室溫15 min；PBS洗滌2次，每次3 min；配制反應(yīng)工作液。取24 μl 25×NBT 加入到 0.6 ml 1×AP 反應(yīng)緩沖液中，混勻后，再加入 24 μl 25×BCIP 混勻，即反應(yīng)工作液；各實(shí)驗(yàn)孔分別加入300 μl反應(yīng)液，置37 ℃，1 h；移除反應(yīng)液，加入去離子水終止反應(yīng)；顯微鏡下拍照。

1.2.6茜素紅染色 誘導(dǎo)結(jié)束后，將各組細(xì)胞用70%乙醇固定。移除孔板內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入400 μl 70%乙醇，室溫1 h；去離子水洗滌2次，每次3 min；各實(shí)驗(yàn)孔分別加入300 μl 1%茜素紅染液，置37 ℃，20 min；移除反應(yīng)液，加入去離子水終止反應(yīng)；顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始呈長(zhǎng)梭形呈旋渦狀生長(zhǎng)，幾乎全部融合，大小形態(tài)均勻一致。見(jiàn)圖1。

圖1 BMSCs體外培養(yǎng)光鏡下形態(tài)學(xué)觀察(×40)

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力0.05 mg/L抗菌肽組細(xì)胞細(xì)胞增殖能力與0 mg/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余各細(xì)胞細(xì)胞增殖能力低于0 mg/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠BMSCs細(xì)胞活力測(cè)試

與0 mg/ml組比較，***P< 0.001；**P< 0.01；*P< 0.05

0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/mL代表相應(yīng)抗菌肽濃度處理組

2.3 細(xì)胞劃痕檢測(cè)遷移能力與0 mg/L抗菌肽組相比，16、32、48、64 mg/L抗菌肽組細(xì)胞遷移能力降低，且濃度增高，細(xì)胞遷移能力減弱；隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞劃痕相對(duì)距離百分比

圖4 不同濃度抗菌肽處理后細(xì)胞遷移能力(×100) a：0 mg/L抗菌肽組；b：16 mg/L抗菌肽組；c：32 mg/L抗菌肽組；d：48 mg/L抗菌肽組；e：64 mg/L抗菌肽組

2.4 不同濃度抗菌肽處理后細(xì)胞ALP染色不誘導(dǎo)組ALP含量很少；成骨誘導(dǎo)組中，0、16、32 mg/L抗菌肽組ALP含量較多，染色較深，64 mg/L抗菌肽組鈣結(jié)節(jié)含量較少，染色較淺。見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度抗菌肽處理后細(xì)胞ALP染色 a：不誘導(dǎo)組；b：成骨誘導(dǎo)+0 mg/L抗菌肽組；c：成骨誘導(dǎo)+16 mg/L抗菌肽組；d：成骨誘導(dǎo)+32 mg/L抗菌肽組；e：成骨誘導(dǎo)+48 mg/L抗菌肽組；f：成骨誘導(dǎo)+64 mg/L抗菌肽組(×100)

2.5 不同濃度抗菌肽處理后細(xì)胞茜素紅染色不誘導(dǎo)組無(wú)鈣結(jié)節(jié)形成；成骨誘導(dǎo)組中，0、16、32 mg/L抗菌肽組鈣結(jié)節(jié)含量較多，64 mg/L抗菌肽組鈣結(jié)節(jié)含量較少。見(jiàn)圖6。

圖6 不同濃度抗菌肽處理后細(xì)胞茜素紅染色 a：不誘導(dǎo)組；b：成骨誘導(dǎo)+0 mg/L抗菌肽組；c：成骨誘導(dǎo)+16 mg/L抗菌肽組；d：成骨誘導(dǎo)+32 mg/L抗菌肽組；e：成骨誘導(dǎo)+48 mg/L抗菌肽組；f：成骨誘導(dǎo)+64 mg/L抗菌肽組(×100)

3 討論

牙周病是口腔兩大主要疾病之一，晚期常常引起牙松動(dòng)甚至脫落，是牙列缺損最主要的原因。臨床上常用齦上潔治、齦下刮治、根面平整等方法去除齦上下結(jié)石，但難以從根本上完全消除牙菌斑。四環(huán)素類(lèi)藥物常常作為牙周炎的輔助藥物治療。然而，在治療的同時(shí)也會(huì)帶來(lái)其他的毒副作用，治療過(guò)程中為了保持足夠的需要濃度也會(huì)引起細(xì)菌的耐藥性。此外，普通抗生素也不具備促進(jìn)成骨的效能。

抗菌肽作為天然免疫系統(tǒng)的第一道防線[3]，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物中，對(duì)宿主抵抗微生物入侵具有重要意義，在具有良好抗菌性的同時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，成為最具潛力的抗菌藥物[10]?？咕木哂袕V譜抗菌性，能夠?qū)Χ喾N革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌具有殺滅作用，且不引起細(xì)菌耐藥性[11]，是最具有潛力的抗菌藥物之一，有望取代抗生素。Liu等[12]通過(guò)用MSCs和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶骨性骨缺損模型進(jìn)行體外和體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽LL37顯著促進(jìn)MSC細(xì)胞分化，遷移和增殖，還能體外抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和細(xì)菌活性。KRSR多肽涂層能很好的促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附和成骨分化[13]。已有研究表明，抗菌肽LL-37具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠趨化抗炎因子如IL-1ra、IL-10等聚集到炎癥部位[12]；自組裝抗菌肽KLD-12既具備良好的抗菌能力，又能促進(jìn)組織的快速愈合[14]；桿菌肽通過(guò)刺激骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/Smad軸促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[15]；陽(yáng)離子抗菌肽P15-CSP具有獨(dú)特的雙重能力抑制生物膜的形成，并作為親水性表面的涂層增強(qiáng)成骨活性[16]。本課題為了研究DP7是否也會(huì)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的抗菌肽DP7對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加愈發(fā)明顯。但在100 mg/L濃度范圍以?xún)?nèi)，存活率均達(dá)80%以上，尚未造成大鼠BMSCs細(xì)胞活力的明顯影響。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)化實(shí)驗(yàn)濃度，采用0、16、32、48、64 mg/L濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)是反應(yīng)細(xì)胞遷移能力的方法[17]，骨組織的損傷后修復(fù)依賴(lài)于成骨相關(guān)細(xì)胞的遷移，通過(guò)檢測(cè)劃痕變化反應(yīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的快慢。劃痕區(qū)域相對(duì)距離減短，說(shuō)明細(xì)胞的遷移能力增加。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著抗菌肽濃度的增加，細(xì)胞遷移能力逐漸減弱。經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)及對(duì)DP7生產(chǎn)加工過(guò)程進(jìn)行追溯，分析原因可能是由于抗菌肽生產(chǎn)過(guò)程中加入了某些具有細(xì)胞毒性的試劑，造成DP7對(duì)細(xì)胞具有一定毒性作用。

ALP為成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物，其活性高低可以客觀反映成骨分化程度[18]。而鈣結(jié)節(jié)則是成骨細(xì)胞分化晚期的標(biāo)志物，鈣結(jié)節(jié)的量客觀反映細(xì)胞成骨性能高低[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明抗菌肽DP7對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨性能具有一定的促進(jìn)作用，且在32 mg/L濃度下作用最明顯，此濃度下，DP7既能夠使ALP活性增加，又能夠促進(jìn)鈣化。這與理想效果下以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化有所出入。原因可能是隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，高濃度的DP7對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用超過(guò)了成骨促進(jìn)作用，造成大鼠BMSCs的凋亡。

考慮到本實(shí)驗(yàn)中所用抗菌肽DP7控制感染的作用及促進(jìn)成骨的潛力，制備出同時(shí)具有良好抗菌性能和促進(jìn)成骨性能的新型實(shí)用抗菌肽意義重大。因此，下一步將對(duì)抗菌肽DP7進(jìn)行進(jìn)一步的改性，在保留其良好廣譜抗菌性的同時(shí)，降低其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。