溫室中患白粉病與健康草莓植株根際原核生物群落的比較研究

楊俊譽，魏世杰，蘇代發(fā)，張振榮，陳杉艷，羅志偉，沈雪梅，賴泳紅，Arslan Jamil，童江云*，崔曉龍*

(1. 云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091；2. 昆明市農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 昆明 650034)

【研究意義】草莓(Strawberries)屬于薔薇科Rosaceae草莓屬Fragaria植物，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)發(fā)布的權(quán)威數(shù)據(jù)(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC/visualize)顯示，全世界草莓種植的面積和產(chǎn)量從1994-2016年呈逐年增加的趨勢，而中國草莓種植的規(guī)模同樣逐年擴大，且草莓產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位[1]?！厩叭搜芯窟M展】目前，草莓白粉病(Strawberry Powdery Mildew)已經(jīng)成為危害中國草莓種植、嚴重影響草莓產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟效益的主要真菌病害[2]。由于白粉病危害草莓的葉、花和果實，并在草莓果實的表面形成薄薄的白色菌絲層，而草莓果實是可直接食用的漿果，因此有害化學藥劑的殘留必然會導致食品安全問題和對人體造成的危害，所以高效的分離、篩選對草莓白粉病病原菌具有顯著拮抗功能的植物益生菌，是實現(xiàn)未來草莓產(chǎn)業(yè)能綠色和可持續(xù)發(fā)展的重要途徑[1,3]?！颈狙芯壳腥朦c】根際(Rhizosphere)土壤被認為是植物的“第二基因組”，受植物根部分泌物、微生物和土壤三者的相互作用[4-5]。許多研究發(fā)現(xiàn)，植物病害的發(fā)生與根際微生物多樣性存在一定的相關(guān)性，且病原菌在微生物多樣性高的土壤中很難生存[6-7]。為此，研究根際微生物群落組成與結(jié)構(gòu)變化為防治植物病害發(fā)生提供理論基礎(chǔ)和生防原材料。傳統(tǒng)的研究方法如平板培養(yǎng)法[8-9]、Biolog方法、磷脂肪酸生物標記法(PLFAs)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法等[10]往往不能準確揭示土壤微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)。目前，高通量測序(High-throughput sequencing, HTS)技術(shù)由于操作簡單、成本較低、測序速度快、測序通量大和結(jié)果可靠等優(yōu)勢，在微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)研究中廣泛應(yīng)用。一些研究如趙帆等[11]、Li等[12]和Huang等[13]通過高通量技術(shù)揭示草莓連作過程中根際微生物由“細菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，肖蓉等[7]發(fā)現(xiàn)健康草莓根際細菌群落多樣性高于患炭疽病草莓根際。【擬解決的關(guān)鍵問題】有關(guān)草莓白粉病患病植株根際土壤微生物多樣性的研究報道較少，采用高通量技術(shù)對溫室大棚中草莓白粉病患病植株和健康植株根際土壤中的細菌多樣性進行比較研究，可明確草莓白粉病患病對根際土壤原核微生物多樣性的影響，從微生物生態(tài)學角度探討對白粉病具有抑制作用的生物因子，為解釋草莓白粉病的發(fā)生原理和構(gòu)建科學有效的抗草莓白粉病有益菌的篩選方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3月在云南省昆明市西山區(qū)團結(jié)街道云南創(chuàng)農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司(北緯N25°04′9.00″，東經(jīng)E102°32′12.00″)的溫室大棚里采集草莓品種章姬(Akihime)為試材。大棚里有白粉病發(fā)病嚴重的和不發(fā)病的草莓植株。在發(fā)病區(qū)域內(nèi)選取3處進行“S”形取樣，共采集病株15株，整株挖出用無菌袋低溫保存帶回實驗室，抖掉多余的根部土壤，用無菌毛刷刷取根部表面約2 mm的附著土壤，即根際土壤[14]。將15株發(fā)病植株根際土壤混合成1個樣品置于50 mL無菌離心管中，發(fā)病植株根際土壤樣品命名為DRZ。在發(fā)病區(qū)域相鄰的健康區(qū)域以相同方法采集健康植株，健康植株根際土壤命名為HRZ，將所得樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 根際土壤微生物DNA的提取

稱取根際土壤樣品0.5 g，使用PowerSoil(Mobile Biometry, USA)土壤微生物DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書進行根際土壤微生物DNA的提取，DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高通量測序分析

參照Machuca等[15]的方法，采用原核通用引物16S rRNA基因的V3～V4區(qū)(約430 bp)，考慮同時對細菌和古菌進行分析與研究。將所有草莓根際土壤樣品的基因組DNA分別用無菌去離子水稀釋為1 ng/μl備用，并使用稀釋完成的DNA進行高通量擴增子PCR。本研究中使用高效高保真酶和帶Barcode的特異引物，以及New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行25 μl體系的PCR擴增。

16S rRNA基因的V3～V4區(qū)原核通用引物為[15]：正向引物341F:5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’; 反向引物806R:5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’. PCR擴增條件：95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，進行29個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒對本研究中利用原核通用引物擴增出的目標條帶進行切膠回收。隨后的文庫構(gòu)建和文庫質(zhì)量檢測分別使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒和Qubit及Q-PCR進行定量，最終使用HiSeq 2500 PE250進行測序，本研究中的所有樣品均由天津諾禾致源科技股份有限公司完成測序。

表1 草莓根際土壤微生物的序列信息Table 1 Sequence information of rhizosphere microorganism of strawberries

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用FLASH(V1.2.7)軟件對每個樣品的reads進行拼接，最終得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。Tags數(shù)據(jù)的質(zhì)控、過濾和嵌合體的剔除均由軟件Qiime(V1.7.0)完成，最終獲得有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用97 %的一致性(Identity)閾值將有效序列聚類成為OTU(Operational Taxonomic Unit)，對OTU的篩選和分類通過Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)完成[16-17]。物種注釋是利用Mothur軟件將OTU序列與Silva(http://www.arb-silva.de/)物種數(shù)據(jù)庫進行比對分析，軟件中相關(guān)的閾值設(shè)置為0.8～1；所有樣品的OTU序列利用MUSCLE(Version 3.8.31)軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析[17]。最終，所有草莓根際土壤樣品均通過最少樣本測序量進行抽平處理，然后進行相應(yīng)的原核生物群落的Alpha和Beta多樣性分析。并用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger云平臺完成生物信息學數(shù)據(jù)分析(http://www.i-sanger.com/)。

Alpha多樣性分析能反映草莓根際土壤中原核生物群落的豐富度和多樣性，其中Coverage指數(shù)通過計算各個樣本文庫的覆蓋率反映樣本測序的深度和合理性，數(shù)值越高表明樣本中序列被檢測出的概率越高，測序結(jié)果越可靠[16-19]。Shannon指數(shù)和Simpson指均用于評估草莓根際土壤中原核生物群落多樣性，其中Shannon指數(shù)值越大(或Simpson指數(shù)值越小)，表明樣品中原核生物群落多樣性越高[17]。樣品中原核生物群落的豐富度則通過Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)來反映，而群落的組成則利用Heatmap圖以不同顏色梯度呈現(xiàn)[17-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根際土壤樣品測序質(zhì)量評估

通過對草莓根際土壤微生物16S rRNA基因的V3-V4區(qū)(341F/806R)測序，所有樣品原始序列總條數(shù)為191 611條，過濾優(yōu)化處理后的總有效序列為112 668條。并用97 %相似度進行物種的OTU分類，所有樣品的平均測序長度在420～460 bp。采集的患病草莓根際土壤樣品的OTU數(shù)量低于健康樣品(DRZ

參照文獻[18]對所有樣品選擇相似度為97 %的OTU，進行最小樣本序列數(shù)的抽平，利用高通量測序后各個樣品的Alpha多樣性指數(shù)(OTU的數(shù)量)構(gòu)建草莓根際土壤樣品的稀釋曲線(圖1)。結(jié)果表明，隨測序量的加大，所有草莓樣品的稀釋曲線均趨向于平坦，表明本研究中所有樣品的測序數(shù)據(jù)深度合理，測序結(jié)果能全面和真實的反映所有草莓根際土壤樣本中原核生物群落和結(jié)構(gòu)多樣性的信息。

2.2 草莓根際土壤微生物多樣性分析

所有樣品的Coverage指數(shù)均高于98 %，表明本研究中所有樣品的測序結(jié)果能真實全面的反映草莓根際土壤中原核生物的多樣性?；疾〔葺H土壤微生物的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分別為2074.2196和2111.9406，而健康草莓根際土壤微生物兩者分別為2248.1385和2244.6361，患病樣品的兩者較健康樣品分別減少了8.38 %和6.28 %，說明健康草莓的根際微生物群落豐富度較高；患病草莓根際微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為5.6544和0.0143，而健康草莓根際微生物的兩者平均值分別為5.7529和0.0106，患病樣品的Shannon指數(shù)較健康樣品減少了1.74 %，而Simpson指數(shù)增加了25.87 %?？傮w顯示，所有的微生物群落豐富度和多樣性指標均為患病樣品(DRZ)小于健康樣品(HRZ)，說明健康草莓的根際微生物群落多樣性高于患病樣品。

圖1 草莓根際土壤樣品稀釋曲線圖Fig.1 Rarefaction curves of strawberry rhizosphere soil samples

表2 草莓根際土壤微生物群落豐富度和多樣性Table 2 OTUs’ abundance and diversity of rhizosphere microorganism of strawberries

2.3 草莓根際土壤微生物物種組成分析

2.3.1 門分類水平的比較 草莓根際土壤樣品以最小樣本的測序量進行抽平優(yōu)化，結(jié)合相似度為97 %的分類閾值利用RDP classifier貝葉斯算法對抽平后所有草莓根際土壤樣品的OTU進行物種分類研究[20]，并采用數(shù)據(jù)庫Silva 128/16S數(shù)據(jù)庫進行比對，將所有樣本的OTU進行物種注釋，共獲得OTU個數(shù)為2631，涵蓋了2域2界39門82綱161目326科600屬的原核微生物。利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger云平臺完成了作圖分析(http://www.i-sanger.com/)。根據(jù)各個樣品在門分類水平物種所占比例(即物種的相對豐度)作圖，將每個草莓根際土壤樣品中物種相對豐度低于0.1 %的門類群合并為Others，結(jié)果如圖2所示。圖2A表示2個樣品在門分類水平上的微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu)，共得到相對豐度大于0.1 %的門類有17種，按相對豐度由高到低分別為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、藍藻門Cyanobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、疣微菌門Verrucomicrobia、厚壁菌門Firmicutes、Saccharibacteria等，除細菌門類外，還檢測到古菌的門類：奇古菌門Thaumarchaeota和烏斯古菌門Woesearchaeota(DHVEG-6)，但相對豐度較低。圖2B表示健康草莓根際土壤樣本(HRZ)和患病樣本(DRZ)在門分類水平上相對豐度Top 10的群落組成，進行Fisher’exact test比較，結(jié)果表明患病樣本BRZ中變形菌門(P<0.01)、擬桿菌門(P<0.01)、綠彎菌門(P<0.01)、疣微菌門(P<0.01)和厚壁菌門(P<0.01)均顯著高于健康樣本HRZ，而患病樣本(BRZ)中放線菌門(P<0.01)、酸桿菌門(P<0.01)、藍藻門(P<0.01)和芽單胞菌門(P<0.01)均顯著低于健康樣本HRZ，2個樣本中Saccharibacteria(P= 0.27> 0.05)沒有顯著變化。圖2C表示古菌門類在2個樣本中的差異，患病樣本(DRZ)中奇古菌門(P<0.01)和烏斯古菌門(P= 0.02<0.01)均顯著高于健康樣本(HRZ)。說明，從門的水平上講，在健康草莓根際土壤樣本和患病樣本群落結(jié)構(gòu)中，群落種類大致相同，群落組成比例發(fā)生顯著改變。雖然變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和擬桿菌門均為兩者的優(yōu)勢菌群，但相對豐度存在顯著差異，同時首次發(fā)現(xiàn)了患病植株根際土壤中古菌門類菌群組成比例顯著高于健康植株。

2.3.2 屬分類水平的比較 為進一步解釋草莓根際微生物群落的變化，從屬水平進行分析發(fā)現(xiàn)，健康樣本HRZ和患病樣本BRZ群落組成種類基本相同，但群落組成比例存在明顯差異(圖3)。圖3A表示2個樣品在屬分類水平群落結(jié)構(gòu)和群落比例，其中樣本豐度占比低于1 %的菌群合并為Other。健康樣品HRZ的微生物群落主要為Other(44.5 %)、norank序列(17.23 %)、Acidibacter(5.42 %)、Devosia(5.29 %)、Pseudolabrys(3.12 %)、木洞菌屬Woodsholea(2.84 %)、假單胞菌屬Pseudomonas(2.5 %)、鏈霉菌屬Streptomyces(2.07 %)、土微菌屬Pedomicrobium(2.44 %)、紅游動菌屬Rhodoplanes(1.55 %)等，而患病樣本BRZ的微生物群落主要為Other(43.21 %)、norank序列(13.96 %)、沃爾巴克氏體屬Wolbachia(9.12 %)、木洞菌屬(4.98 %)、鏈霉菌屬(3.29 %)、Acidibacter(3.25 %)、Devosia(3.11 %)、土微菌屬(2.23 %)、立克次體屬Rickettsia(2.23 %)等。因此，2個樣本在屬分類水平上的群落結(jié)構(gòu)基本相同。圖3B表示2個樣本群落Heatmap圖，選擇樣本中物種豐度前50的物種進行分析，根據(jù)物種豐度的相似性進行聚類，通過顏色的變化反映2個樣本在屬分類水平上群落組成的相似性和差異性，表明沃爾巴克氏體屬和立克次體屬在患病樣本BRZ中相對豐度極高，而在健康樣本HRZ中相對豐度最少。圖3C表示2個樣品進行Fisher’exact test比較，并展示了2個樣本中物種相對豐度前30的菌群，其中患病樣本BRZ中物種相對豐度顯著高于健康樣本HRZ的菌群有沃爾巴克氏體屬(P<0.01)、木洞菌屬(P<0.01)、鏈霉菌屬(P<0.01)、立克次體屬(P<0.01)和Dongia(P<0.01)等；患病樣本BRZ中物種相對豐度顯著低于健康樣本HRZ的菌群有Acidibacter(P<0.01)、Devosia(P<0.01)、Pseudolabrys(P<0.01)、土微菌屬(P= 0.047<0.05)、假單胞菌屬(P<0.01)、Bauldia(P= 0.03<0.05)、Variibacter(P<0.01)、Rhizomicrobium(P= 0.039<0.05)、紅游動菌屬(P<0.01)、慢生根瘤菌Bradyrhizobium(P<0.01)等。健康樣本HRZ中絕大部分的菌群相對豐度均顯著高于患病樣本BRZ。圖3D表示古菌在屬分類水平物種相對豐度的變化情況，由于古菌在2個樣本中相對豐度較低，單獨對古菌類群進行比較分析，結(jié)果表明患病樣本BRZ中Candidatus_Nitrosoarchaeum(P<0.01)、norank_p_Woesearchaeota(DHVEG-6)(P<0.01)和norank_c_Marine_Group_I(P= 0.03<0.05)(簡稱norank類群)等古菌類群均顯著高于健康樣本HRZ。

A：樣品群落結(jié)構(gòu)圖；B：物種相對豐度Top 10比較圖；C：2個樣本古菌屬群落比較圖A: Sample community structure map; B: Comparison of species relative abundance Top 10; C: Comparison of archaeal communities between two samples圖2 原核生物門分類水平的群落比較Fig.2 Comparison of prokaryotic community at phylum level

3 討 論

利用高通量測序技術(shù)對16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)的原核生物通用引物341F/806R進行測序分析，檢測了溫室大棚中患白粉病草莓根際與健康草莓根際原核生物群落多樣性。在97 %的相似度水平下共獲得OTU個數(shù)為2631，涵蓋了2域2界39門82綱161目326科600屬的原核生物的群落信息。測序結(jié)果表明，同時檢測到細菌類群和古菌類群的群落信息，并首次闡述了溫室中患白粉病草莓根際與健康草莓根際細菌類群和古菌類群的群落多樣性。

在患白粉病的溫室大棚中，同時存在患病植株和健康植株，研究表明患病草莓根際土壤微生物(包括細菌和古菌)的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)等多樣性指數(shù)值均低于健康植株根際土壤?；疾颖?BRZ)和健康樣本(HRZ)在門分類水平上得到的優(yōu)勢菌群均為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中變形菌門在2個樣本中的相對豐度均為最高。同時還檢測到在2個樣本中均包含兩個古菌門類：奇古菌門和烏斯古菌門，患病植株根際土壤中古菌門類菌群顯著高于健康植株。因此，2個樣本門分類水平菌群組成大致相同，但相對豐度存在顯著差異。許多研究表明，健康植株根際土壤微生物數(shù)量多、多樣性高，如：肖蓉等[7]以健康草莓根際與患炭疽病草莓根際為研究對象，發(fā)現(xiàn)健康草莓根際細菌群落組成和多樣性指數(shù)顯著高于患病根際土。趙帆等[11]和Li等[12]揭示不同連作草莓根際細菌和真菌多樣性的發(fā)生顯著變化。

在屬分類水平上，健康樣本(HRZ)的優(yōu)勢菌屬為norank類群、Acidibacter、Devosia、Pseudolabrys、木洞菌屬、假單胞菌屬等，而患病樣本(BRZ)的優(yōu)勢菌屬為norank類群、沃爾巴克氏體屬、木洞菌屬、鏈霉菌屬、Acidibacter、Devosia等，2個樣本在屬分類水平上的細菌群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，同時還檢測到患病樣本中的古菌在屬分類水平上的群落豐度顯著低于健康樣本。因此，草莓根際土壤細菌類群和古菌類群多樣性降低、群落結(jié)構(gòu)改變是草莓白粉病發(fā)生的病因之一。

A：樣品群落結(jié)構(gòu)圖；B：物種相對豐度Top 50的Heatmap圖；C：2個樣本群落比較圖；D：2個樣本古菌屬群落比較圖A:Sample community structure map; B: A Heat map of the relative abundance of species Top 50; C: Comparison of two sample communities; D: Comparison of archaeal communities between two samples圖3 原核生物屬分類水平的群落比較Fig.3 Comparison of prokaryotic community at genus level

國內(nèi)外研究表明，假單胞菌屬的細菌具有拮抗、固氮、溶磷和產(chǎn)IAA等豐富多樣的促生和抗菌功能，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[5, 7]。武哲等[21]從土樣中分離得到放線菌菌株1706，通過分子鑒定該菌株為利尻鏈霉菌Streptomycesrishiriensis，利用其發(fā)酵濾液對草莓白粉病防效達81.25 %，是防治草莓白粉病的潛在生防菌株。實驗中假單胞菌屬在健康樣本(HRZ)中占2.5 %，而在患病樣本(BRZ)中占0.66 %，健康植株根際土壤含量顯著高于患病植株樣本(P<0.01)。因此，根據(jù)純培養(yǎng)的方法，可以從健康樣本中選擇性培養(yǎng)假單胞菌屬細菌，從中篩選防治草莓白粉病的拮抗菌，為生防菌的篩選提供一條捷徑。鏈霉菌屬在健康樣本中含量顯著低于患病樣本(P<0.01)，說明有更多的鏈霉菌屬參與了草莓白粉病的防御工作，作為具有防治草莓白粉病的潛在生防菌屬，將為生物防治提供有效的生防材料。此外，還有古菌類群被檢測出來，雖然含量較少，但在2個樣本中的含量卻具有顯著差異，因此，在解釋和闡述草莓白粉病發(fā)生和生防機制時可以考慮其作用。

值得注意的是，沃爾巴克氏體屬和立克次體屬在患病草莓根際土壤中被檢查出來，含量分別為9.12 %和2.23 %，而在健康樣本中含量分別為0.03 %和0.01 %，差異顯著且在健康樣本中含量極少。有研究表明，沃爾巴克氏體屬能與現(xiàn)階段地球上存在的1000～3000萬種昆蟲種類中66 %以上的昆蟲種類共生，它可能是節(jié)肢動物共生微生物中分布范圍最廣，感染豐度最大的類群[22-23]。在溫室大棚中，很少有風或強氣流的流動，不具備白粉病傳播擴散的條件，但在溫室大棚中，能觀察到不同區(qū)域爆發(fā)白粉病。因此，與昆蟲共生的沃爾巴克氏體屬含量的變化，說明可能昆蟲作為病害的傳播媒介，導致草莓白粉病的傳播。所以，在溫室大棚中進行草莓白粉病防治時，應(yīng)考慮昆蟲傳播病害的潛在危害。立克次體屬是一類具有傳播和引起人類與其它脊椎動物疾病的胞內(nèi)共生菌，其中能引起脊椎動物疾病的立克次體屬細菌，其部分生活史是在節(jié)肢動物體內(nèi)完成[24]。因此，從食品安全的角度考慮，患白粉病的草莓植株不應(yīng)用于動物飼料及其它生產(chǎn)加工用途，草莓果實也不應(yīng)加工成產(chǎn)品供人類食用。同時研究發(fā)現(xiàn)2個樣本中存在大量的norank類群，目前的數(shù)據(jù)庫中無法獲取該部分序列的分類學信息，推測該部分序列可能是一些新的微生物類群，因此，還需使用其它的技術(shù)手段進一步鑒定，從中獲取有用的潛在微生物資源。

4 結(jié) 論

溫室中患白粉病草莓植株根際土壤原核生物多樣性顯著低于健康草莓根際土壤(P<0.01)，兩者根際的細菌類群和古菌類群的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，究其原因是草莓根際原核生物多樣性降低、群落結(jié)構(gòu)的改變；而假單胞菌屬和鏈霉菌屬可作為防治草莓白粉病的潛在生防資源；溫室中，昆蟲扮演了草莓白粉病傳播者的角色；同時，患白粉病的草莓果實應(yīng)禁止供人類和動物食用。