提取鼠曲草粗多糖去除蛋白質(zhì)方法的比較研究

劉品華，謝景文，康照金，馮亞娟，汪 帆

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011)

【研究意義】鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)，又稱清明菜，菊科，簇生，一年生草本，生于海拔1600～2700 m的田埂、荒地、路旁，尤以稻田最常見。清明節(jié)前民間采集嫩尖食用。每100 g嫩莖葉中含水分85 g、蛋白質(zhì)3.1 g、脂肪0.6 g、碳水化合物7 g、熱量192.56 kJ、粗纖維2.1 g、灰分2.4 g、鈣218 mg、磷66 mg、鐵7.4 mg、胡蘿卜素2.19 mg、硫胺素0.03 mg、核黃素0.24 mg、尼克酸1.4 mg、抗壞血酸28 mg[1]。莖葉入藥，有化痰止咳、清熱利濕，活血降壓，治氣喘、咳嗽痰多、濕熱黃疸以及潰瘍的功效[2]。有研究表明，鼠曲草具有多種生物活性，在營養(yǎng)保健、生物農(nóng)藥、化妝品等方面都有一定的應(yīng)用價(jià)值，資源豐富，藥食兩用，是一種極具開發(fā)利用潛質(zhì)的生物資源[3]。目前已有報(bào)道的天然多糖化合物約有300多種[4]。根據(jù)多糖來源主要分為植物類和動(dòng)物類多糖，普遍存在于植物、動(dòng)物、菌類、藻類等中，是由10個(gè)以上各種單糖組成的天然高分子化合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬甚至數(shù)百萬，是自然界中含量和種類最為豐富的生物聚合物，多數(shù)具有突出生物活性的多糖都具有β(1→3)-D-葡聚糖的主鏈結(jié)構(gòu)，是一類具有重要活性的物質(zhì)[5-6]，有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抑制抗腫瘤、抗衰老、抗凝血、抗寄生蟲、抗輻射、抗?jié)?、?zhèn)痛、預(yù)防急性腎衰、降血脂、降血糖、保護(hù)胃腸、抗氧化等功效，且毒副作用小，不易造成殘留等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[7-11]。天然植物中往往是多糖與蛋白質(zhì)共存，還有些以糖蛋白復(fù)合物的形式存在，這使得蛋白質(zhì)的分離變得尤為重要，如何有效去除蛋白質(zhì)保留多糖成為一個(gè)突出的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于不同植物中粗多糖、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，純化粗多糖時(shí)最佳去除蛋白質(zhì)方法也不同，其主要有沉淀法、酶法及酶法與其它的組合方法。從鼠曲草中提取粗多糖去除蛋白質(zhì)還未見相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】提取純化粗多糖是研發(fā)的基礎(chǔ)，為此研究比較了8種去除鼠曲草粗多糖中蛋白質(zhì)方法的效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究從鼠曲草中提取粗多糖，最優(yōu)去除蛋白質(zhì)和保留粗多糖的技術(shù)方法，旨在為深入研究和開發(fā)鼠曲草粗多糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠曲草(云南省曲靖市麒麟?yún)^(qū)郊外田間地頭采摘)，去花蕾后80 ℃烘干，粉碎過60目篩備用；考馬斯亮藍(lán)G250(南京奧多福尼生物科技有限公司，AR)；牛血清白蛋白(南京奧多福尼生物科技有限公司，BR)；木瓜蛋白酶(30萬 U/g，北京鑫達(dá)食品添加劑有限公司，食品級)，其他均為AR試劑。

紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；電子天平[AL204-IC，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；臺式離心機(jī)(LD-4，常州天瑞儀器有限公司)；離心機(jī)(低速離心機(jī)，常州國華電器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S2s，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；超聲波儀(PS-40，深圳市超聲藝達(dá)科技有限公司)；旋渦混合器(XH-C上海汗諾儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取 稱一定量鼠曲草干粉備用，加入5倍鼠曲草質(zhì)量的純水浸潤，然后加入4倍水量的無水乙醇(調(diào)整乙醇濃度為80 % vol)，置于400 W超聲儀中超聲30 min，抽濾，棄除上清液，不溶物用80 % vol乙醇洗滌2次，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入10～15倍不溶物的純水，沸水浴2 h，取出冷卻至室溫，濾渣用同樣條件再重復(fù)提取2次, 合并3次提取液，得試樣儲備液。

1.2.2 蛋白質(zhì)的檢測 參照SN/T 3926-2014標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測。準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白9.8 mg，用100 mL容量瓶加純水溶解后定容至刻度，得0.98 mg/mL牛血清白蛋白儲備液。分別吸取牛血清白蛋白儲備液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL試管中，加純水補(bǔ)充至1.0 mL，再向各試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(準(zhǔn)確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于95 %的乙醇50 mL中，再加入85 %的磷酸100 mL，用純水定容至1000 mL容量瓶，過濾，得清液)，用漩渦混合器混合均勻后，室溫放置2 min，以零管為空白，用1 cm比色管在595 nm波長處測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)白蛋白質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程：y=0.0375x+0.6250，R2=0.9993。取1.0 mL試樣儲備液，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法檢測吸光度(用水代替試樣儲備液作空白)，計(jì)算蛋白質(zhì)含量(下述方法中稀釋的按稀釋倍數(shù)計(jì)算)。

1.2.3 多糖的檢測 參照SN/T 4260-2015方法進(jìn)行粗多糖檢測。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，用純水定容至1000 mL容量瓶得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(濃度為100 μg/mL)。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL具塞試管中，補(bǔ)充純水至1.0 mL，向試液中加入新蒸苯酚配制的5 %的溶液1.0 mL，然后垂直液面加入5.0 mL濃硫酸，靜止10 min，使用旋渦混合器混合均勻后，將具塞試管放置于30 ℃水浴中30 min，用1 cm比色管在490 nm處檢測吸光度，用葡萄糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程為y=0.0113x+0.0117，R2=0.9997。分別取1.0 mL試樣儲備液，同標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測吸光度，計(jì)算粗多糖含量(下述方法中稀釋的按稀釋倍數(shù)計(jì)算)。

1.2.4 堿性法 在5支50 mL離心試管中分別取25.0 mL試樣儲備液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH值為8、9、10、11、12，混合均勻后，靜置過夜，于4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的氫氧化鈉水溶液旋渦震蕩后離心，清液并入容量瓶，沉淀同法再重復(fù)1次。清液用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)整pH≈7，然后用純水定容至刻度，搖勻得檢測液，同1.2.2、1.2.3中方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

1.2.5 酸性法 在5支50 mL離心試管中分別取25.0 mL試樣儲備液，用1 mol/L鹽酸分別調(diào)pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，混合均勻后，放置于4 ℃冰箱中靜置過夜[12-13]，于4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的鹽酸水溶液旋渦震蕩后離心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重復(fù)1次。用純水定容至刻度得檢測液，同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

1.2.6 醋酸鉛法 在5支50 mL離心試管中各取25.0 mL試樣儲備液，分別滴加濃度為0.001、0.005、0.010、0.020、0.030 g/mL醋酸鉛溶液至無沉淀析出，于4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL純水旋渦震蕩后離心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重復(fù)1次。用純水定容至刻度得檢測液，同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

1.2.7 三氯乙酸法 在5個(gè)50 mL容量瓶中分別加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸，用試樣儲備液定容至刻度(濃度分別為5.0、10.0、30.0、50.0、70.0 mg/mL)。分別轉(zhuǎn)入5支50 mL離心試管中旋渦震蕩20 min后靜置30 min，于4500 r/min離心15 min取上清液得檢測液，同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

1.2.8 Sevag法 分別在5個(gè)250 mL錐形瓶中，吸取150.0 mL試樣儲備液，按試樣儲備液與Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v)為5∶1(v/v)混合后劇烈震蕩20 min[13～14]，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中于4500 r/min離心10 min，棄除下層有機(jī)相以及中間生成的凝聚物。分別各處理1、2、3、4、5次后，收集離心的上層清液得檢測液，同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。Sevag試劑更改為，氯仿∶正丁醇=5∶1同法操作進(jìn)行考查。

1.2.9 木瓜蛋白酶—堿性法 按參照文獻(xiàn)[15]作適當(dāng)修改。在1 L的錐形瓶中取試樣儲備液500 mL、木瓜蛋白酶1.5 g混勻，置于60 ℃水浴2 h，沸水浴10 min，待試液冷卻至室溫得水解液。在5支50 mL離心試管中分別各取25.0 mL水解液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH值為8、9、10、11、12，混合均勻后，靜置過夜，4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的氫氧化鈉水溶液旋渦震蕩后離心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重復(fù)1次，合并的清液調(diào)整pH≈7。用純水定容至刻度。從容量瓶中取出10 mL到50 mL離心管中，再加入40 mL無水乙醇，4500 r/min離心10 min棄除上清液，沉淀加80 %的乙醇約10 mL震蕩、離心，沉淀再同法重復(fù)洗滌2次。固體轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中用純水定容至刻度得不同pH值沉淀處理后制得的檢測液，同1.2.2、1.2.3方法檢測蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

1.2.10 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 在5個(gè)50 mL容量瓶中分別加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸，用1.2.9中制得的水解液定容至刻度，按1.2.7方法處理后，取離心后的清液10 mL到50 mL離心管中，再加入40 mL無水乙醇，以下步驟同1.2.9。

1.3 數(shù)據(jù)處理

(1)

Xi：蛋白質(zhì)清除率(%)；R1：試樣儲備液中蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg)；R2：上述各方法除蛋白質(zhì)后計(jì)算為與R1同等體積中殘留蛋白質(zhì)的質(zhì)量(μg)。

(2)

Yi：多糖損失率(%)；T1：試樣儲備液中粗多糖質(zhì)量(μg)；T2：上述各方法除蛋白后檢測液中粗多糖計(jì)算為與T1同等體積中的剩余粗多糖質(zhì)量(μg)。

精密度采用在重復(fù)性條件下獲得的二次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10 %。以二次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值為結(jié)果表示。

綜合指標(biāo)(Zi)參考文獻(xiàn)[16]作適當(dāng)修改。通過蛋白質(zhì)的清除率和多糖損失率加權(quán)重進(jìn)行評價(jià)考查。

計(jì)算公式：Zi=(100-Yi)×0.5+Xi×0.5

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性法

取鼠曲草2 g加約50 mL水煮沸后離心，清液滴加碘溶液，不顯藍(lán)色，說明鼠曲草莖葉中不含淀粉，符合SN/T 4260標(biāo)準(zhǔn)檢測粗多糖含量要求。檢測得知鼠曲草干粉中粗多糖含量3.262 %，蛋白質(zhì)含量0.375 %。

強(qiáng)堿可以裂解多糖與蛋白的連接鍵，同時(shí)利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的性質(zhì)，沉淀去除多糖提取液中的堿性蛋白[12]。

由表1可知，隨著溶液堿性的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的清除率也逐漸增加，pH12的蛋白質(zhì)清除率比pH值11的增加3.52 %，但粗多糖損失率也增加2.55 %，綜合指標(biāo)(Zi)值僅增加0.49 %，堿性越強(qiáng)多糖糖苷鍵更易被破壞，建議pH不超過11。

2.2 鹽酸酸法

酸法與堿法的原理相似，是酸性蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的作用而沉淀。酸性越強(qiáng)溫度越高多糖中糖苷鍵更易斷裂，造成多糖損失，采用酸法應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

表1 堿性法檢測結(jié)果Table 1 The test results of alkaline process

表2 酸性法檢測結(jié)果Table 2 The test results of acid process

由表2可知，綜合指標(biāo)(Zi)最好的是pH值為4，最高蛋白質(zhì)清除率只有28.83 %，說明鼠曲草中的多數(shù)蛋白質(zhì)不是酸性蛋白，清除率較低，不建議用酸法去除鼠曲草粗多糖中的蛋白質(zhì)。

2.3 醋酸鉛法

重金屬鹽類與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性重金屬蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀析出，適合于蛋白質(zhì)含量較高的多糖溶液。

由表3可知，醋酸鉛濃度為0.03 g/mL時(shí)，綜合指標(biāo)(Ze)考查最好，蛋白質(zhì)清除率達(dá)到97.55 %，是最佳條件。

2.4 三氯乙酸法

三氯乙酸法(Trichloroacetic acid，TCA)是根據(jù)蛋白質(zhì)在有機(jī)酸的作用下形成不可逆沉淀。一般操作方法是在多糖水溶液中滴加3 %等體積的TCA，混勻后靜置過夜，離心去除膠狀沉淀，重復(fù)以上的操作即可得到無蛋白的多糖溶液[12]。

由表4可知，隨著三氯乙酸用量的增加，總體上蛋白質(zhì)的清除率和多糖的損失率都在升高。綜合指標(biāo)評價(jià)三氯乙酸濃度70 mg/mL時(shí)最好，比三氯乙酸濃度50 mg/mL提高1.23 %。由于三氯乙酸法脫蛋白質(zhì)時(shí)反應(yīng)較為劇烈，當(dāng)三氯乙酸濃度過高時(shí)會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致多糖降解分子變小，產(chǎn)生不期望的結(jié)果[13,15]，建議三氯乙酸濃度控制在50～70 mg/mL。

表3 醋酸鉛法檢測結(jié)果Table 3 The test results of lead acetate method

表4 三氯乙酸法檢測結(jié)果Table 4 The test results of trichloroacetic acid method

2.5 Sevag法

Sevag法的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)進(jìn)行分離[17]，雖然該方法條件溫和，是脫蛋白的經(jīng)典方法，但需要反復(fù)處理樣品多次，而且只能去除游離的蛋白質(zhì)，對于與多糖緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)(糖蛋白)無法去除，除蛋白質(zhì)時(shí)變性的膠狀物會導(dǎo)致多糖損失[12]。

由表5得知，Sevag法粗多糖的損失率都高于蛋白質(zhì)的清除率。氯仿∶正丁醇=4∶1重復(fù)5次的蛋白質(zhì)清除率為16.92 %，綜合指標(biāo)考查最好為47.89 %。氯仿∶正丁醇=5∶1的重復(fù)5次的蛋白質(zhì)清除率為7.72 %，綜合指標(biāo)考查最好為48.34 %，該方法不適用于鼠曲草粗多糖中去除蛋白質(zhì)。

2.6 酶法

酶的作用是使多糖提取液中蛋白質(zhì)水解生成小分子氨基酸，達(dá)到去除粗多糖中蛋白質(zhì)的目的。因?yàn)槊敢彩且环N蛋白質(zhì)，所以水解后還需用其它脫蛋白質(zhì)和脫氨基酸方法除去酶和氨基酸。為此考查了木瓜蛋白酶處理后再用堿性法、三氯乙酸法除去木瓜蛋白酶，用80 %乙醇洗滌除去氨基酸的效果。

2.6.1 木瓜蛋白酶—堿性法 由表6與表1比較可知，酶—堿法處理后去除蛋白質(zhì)效果好于單用堿處理的方法。pH值9時(shí)綜合指標(biāo)最高，達(dá)到79.48 %，與pH值10、pH值11分別只相差0.51 %、0.95%，所以該法pH要控制在9～11。

表5 Sevag法檢測結(jié)果Table 5 The test results of Sevag method

注：a表示氯仿∶正丁醇=4∶1；b表示氯仿∶正丁醇=5∶1。
Note：ashowed Chloroform ∶ N-butanol = 4∶1 (Vol);bshowed Chloroform ∶ N-butanol = 5∶1 (Vol).

表6 木瓜蛋白酶—堿性法檢測結(jié)果Table 6 The test results papain-alkaline method

2.6.2 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 三氯乙酸有終止木瓜蛋白酶的作用[18]。由表7可知，木瓜蛋白酶—三氯乙酸法除去鼠曲草中的蛋白質(zhì)較為徹底。但粗多糖的損失率整體都很高，從綜合指標(biāo)考查，建議三氯乙酸濃度要小于5 mg/mL。

2.7 8種方法中最優(yōu)效果比較

8種方法最優(yōu)效果比較見圖1。

表7 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法檢測結(jié)果Table 7 The test results of papain-trichloroacetic acid method

3 討 論

謝麗源等比較了Sevag法和三氯乙酸法去除桑黃多糖提取液中蛋白質(zhì)的情況，結(jié)果顯示三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于Sevag法[19]，與我們的結(jié)果一致。多糖主要有兩種存在形式，一種是單糖由苷鍵鏈接形成的多糖，另一種是由糖鏈與肽鏈結(jié)合形成的糖蛋白。三氯乙酸法、堿法、酸法都存在破壞糖苷鍵或改變活性的可能，濃度需盡可能的低。醋酸鉛法存在去除糖蛋白的可能。蛋白酶法是否對糖蛋白有水解作用需進(jìn)一步的研究。所以在去除蛋白質(zhì)的過程中要充分考慮多糖的存在形式和希望得到的多糖形式。

1:堿法(pH=13);2:堿法(pH=4)；3:醋酸鉛法(0.03 g/mL);4:三氯乙酸法(6.54 %);5:Sevag法(4∶1)5次；6:Sevag法(5∶1)5次；7:酶-氫氧化鈉法(pH=9);8:酶-三氯乙酸法(0.5 %)圖1 8種方法中最優(yōu)效果的比較Fig.1 Comparison of the best effects of the 8 methods

從圖1可見，提取鼠曲草粗多糖去除蛋白質(zhì)效果排序是醋酸鉛法>三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—?dú)溲趸c法>氫氧化鈉法>鹽酸法 >Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)>Sevag法(氯仿∶正丁醇=5∶1)。其中醋酸鉛法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶—三氯乙酸法效果較好，可依據(jù)鼠曲草粗多糖提取純化目的要求進(jìn)行選擇。Sevag法、堿法、酸法不建議采用。從醋酸鉛法和木瓜蛋白酶—三氯乙酸法的結(jié)果比較推測，鼠曲草中的粗多糖主要由單糖構(gòu)成。

4 結(jié) 論

上述8種鼠曲草去除蛋白質(zhì)的方法中。木瓜蛋白酶—三氯乙酸法蛋白質(zhì)清除率可達(dá)到100 %，但粗多糖損失率也較高，適用于蛋白質(zhì)含量要求低的粗多糖分離。醋酸鉛法蛋白質(zhì)清除率可達(dá)到97 %，粗多糖損失率相對較低，適用于量較大的粗多糖的提取分離。