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    提取鼠曲草粗多糖去除蛋白質(zhì)方法的比較研究

    2020-04-22 06:25:08劉品華謝景文康照金馮亞娟
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年1期
    關(guān)鍵詞:檢測

    劉品華,謝景文,康照金,馮亞娟,汪 帆

    (曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南 曲靖 655011)

    【研究意義】鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don),又稱清明菜,菊科,簇生,一年生草本,生于海拔1600~2700 m的田埂、荒地、路旁,尤以稻田最常見。清明節(jié)前民間采集嫩尖食用。每100 g嫩莖葉中含水分85 g、蛋白質(zhì)3.1 g、脂肪0.6 g、碳水化合物7 g、熱量192.56 kJ、粗纖維2.1 g、灰分2.4 g、鈣218 mg、磷66 mg、鐵7.4 mg、胡蘿卜素2.19 mg、硫胺素0.03 mg、核黃素0.24 mg、尼克酸1.4 mg、抗壞血酸28 mg[1]。莖葉入藥,有化痰止咳、清熱利濕,活血降壓,治氣喘、咳嗽痰多、濕熱黃疸以及潰瘍的功效[2]。有研究表明,鼠曲草具有多種生物活性,在營養(yǎng)保健、生物農(nóng)藥、化妝品等方面都有一定的應(yīng)用價值,資源豐富,藥食兩用,是一種極具開發(fā)利用潛質(zhì)的生物資源[3]。目前已有報道的天然多糖化合物約有300多種[4]。根據(jù)多糖來源主要分為植物類和動物類多糖,普遍存在于植物、動物、菌類、藻類等中,是由10個以上各種單糖組成的天然高分子化合物,其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬甚至數(shù)百萬,是自然界中含量和種類最為豐富的生物聚合物,多數(shù)具有突出生物活性的多糖都具有β(1→3)-D-葡聚糖的主鏈結(jié)構(gòu),是一類具有重要活性的物質(zhì)[5-6],有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抑制抗腫瘤、抗衰老、抗凝血、抗寄生蟲、抗輻射、抗?jié)儭㈡?zhèn)痛、預(yù)防急性腎衰、降血脂、降血糖、保護(hù)胃腸、抗氧化等功效,且毒副作用小,不易造成殘留等優(yōu)點而備受關(guān)注[7-11]。天然植物中往往是多糖與蛋白質(zhì)共存,還有些以糖蛋白復(fù)合物的形式存在,這使得蛋白質(zhì)的分離變得尤為重要,如何有效去除蛋白質(zhì)保留多糖成為一個突出的問題?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于不同植物中粗多糖、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同,純化粗多糖時最佳去除蛋白質(zhì)方法也不同,其主要有沉淀法、酶法及酶法與其它的組合方法。從鼠曲草中提取粗多糖去除蛋白質(zhì)還未見相關(guān)報道。【本研究切入點】提取純化粗多糖是研發(fā)的基礎(chǔ),為此研究比較了8種去除鼠曲草粗多糖中蛋白質(zhì)方法的效果?!緮M解決的關(guān)鍵問題】研究從鼠曲草中提取粗多糖,最優(yōu)去除蛋白質(zhì)和保留粗多糖的技術(shù)方法,旨在為深入研究和開發(fā)鼠曲草粗多糖提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    鼠曲草(云南省曲靖市麒麟?yún)^(qū)郊外田間地頭采摘),去花蕾后80 ℃烘干,粉碎過60目篩備用;考馬斯亮藍(lán)G250(南京奧多福尼生物科技有限公司,AR);牛血清白蛋白(南京奧多福尼生物科技有限公司,BR);木瓜蛋白酶(30萬 U/g,北京鑫達(dá)食品添加劑有限公司,食品級),其他均為AR試劑。

    紫外可見分光光度計(TU-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);電子天平[AL204-IC,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];臺式離心機(jī)(LD-4,常州天瑞儀器有限公司);離心機(jī)(低速離心機(jī),常州國華電器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S2s,金壇市大地自動化儀器廠);超聲波儀(PS-40,深圳市超聲藝達(dá)科技有限公司);旋渦混合器(XH-C上海汗諾儀器有限公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 多糖的提取 稱一定量鼠曲草干粉備用,加入5倍鼠曲草質(zhì)量的純水浸潤,然后加入4倍水量的無水乙醇(調(diào)整乙醇濃度為80 % vol),置于400 W超聲儀中超聲30 min,抽濾,棄除上清液,不溶物用80 % vol乙醇洗滌2次,轉(zhuǎn)移至燒杯中,加入10~15倍不溶物的純水,沸水浴2 h,取出冷卻至室溫,濾渣用同樣條件再重復(fù)提取2次, 合并3次提取液,得試樣儲備液。

    1.2.2 蛋白質(zhì)的檢測 參照SN/T 3926-2014標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測。準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白9.8 mg,用100 mL容量瓶加純水溶解后定容至刻度,得0.98 mg/mL牛血清白蛋白儲備液。分別吸取牛血清白蛋白儲備液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL試管中,加純水補(bǔ)充至1.0 mL,再向各試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(準(zhǔn)確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G250,溶于95 %的乙醇50 mL中,再加入85 %的磷酸100 mL,用純水定容至1000 mL容量瓶,過濾,得清液),用漩渦混合器混合均勻后,室溫放置2 min,以零管為空白,用1 cm比色管在595 nm波長處測定吸光度,用標(biāo)準(zhǔn)白蛋白質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖,得回歸方程:y=0.0375x+0.6250,R2=0.9993。取1.0 mL試樣儲備液,同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法檢測吸光度(用水代替試樣儲備液作空白),計算蛋白質(zhì)含量(下述方法中稀釋的按稀釋倍數(shù)計算)。

    1.2.3 多糖的檢測 參照SN/T 4260-2015方法進(jìn)行粗多糖檢測。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g,用純水定容至1000 mL容量瓶得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(濃度為100 μg/mL)。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL具塞試管中,補(bǔ)充純水至1.0 mL,向試液中加入新蒸苯酚配制的5 %的溶液1.0 mL,然后垂直液面加入5.0 mL濃硫酸,靜止10 min,使用旋渦混合器混合均勻后,將具塞試管放置于30 ℃水浴中30 min,用1 cm比色管在490 nm處檢測吸光度,用葡萄糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖,得回歸方程為y=0.0113x+0.0117,R2=0.9997。分別取1.0 mL試樣儲備液,同標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測吸光度,計算粗多糖含量(下述方法中稀釋的按稀釋倍數(shù)計算)。

    1.2.4 堿性法 在5支50 mL離心試管中分別取25.0 mL試樣儲備液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH值為8、9、10、11、12,混合均勻后,靜置過夜,于4500 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的氫氧化鈉水溶液旋渦震蕩后離心,清液并入容量瓶,沉淀同法再重復(fù)1次。清液用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)整pH≈7,然后用純水定容至刻度,搖勻得檢測液,同1.2.2、1.2.3中方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

    1.2.5 酸性法 在5支50 mL離心試管中分別取25.0 mL試樣儲備液,用1 mol/L鹽酸分別調(diào)pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,混合均勻后,放置于4 ℃冰箱中靜置過夜[12-13],于4500 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的鹽酸水溶液旋渦震蕩后離心,清液并入容量瓶,沉淀再同法重復(fù)1次。用純水定容至刻度得檢測液,同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

    1.2.6 醋酸鉛法 在5支50 mL離心試管中各取25.0 mL試樣儲備液,分別滴加濃度為0.001、0.005、0.010、0.020、0.030 g/mL醋酸鉛溶液至無沉淀析出,于4500 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,沉淀加5 mL純水旋渦震蕩后離心,清液并入容量瓶,沉淀再同法重復(fù)1次。用純水定容至刻度得檢測液,同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

    1.2.7 三氯乙酸法 在5個50 mL容量瓶中分別加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸,用試樣儲備液定容至刻度(濃度分別為5.0、10.0、30.0、50.0、70.0 mg/mL)。分別轉(zhuǎn)入5支50 mL離心試管中旋渦震蕩20 min后靜置30 min,于4500 r/min離心15 min取上清液得檢測液,同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

    1.2.8 Sevag法 分別在5個250 mL錐形瓶中,吸取150.0 mL試樣儲備液,按試樣儲備液與Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,v/v)為5∶1(v/v)混合后劇烈震蕩20 min[13~14],轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中于4500 r/min離心10 min,棄除下層有機(jī)相以及中間生成的凝聚物。分別各處理1、2、3、4、5次后,收集離心的上層清液得檢測液,同1.2.2、1.2.3方法測定蛋白質(zhì)、粗多糖含量。Sevag試劑更改為,氯仿∶正丁醇=5∶1同法操作進(jìn)行考查。

    1.2.9 木瓜蛋白酶—堿性法 按參照文獻(xiàn)[15]作適當(dāng)修改。在1 L的錐形瓶中取試樣儲備液500 mL、木瓜蛋白酶1.5 g混勻,置于60 ℃水浴2 h,沸水浴10 min,待試液冷卻至室溫得水解液。在5支50 mL離心試管中分別各取25.0 mL水解液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH值為8、9、10、11、12,混合均勻后,靜置過夜,4500 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,沉淀加5 mL對應(yīng)pH值的氫氧化鈉水溶液旋渦震蕩后離心,清液并入容量瓶,沉淀再同法重復(fù)1次,合并的清液調(diào)整pH≈7。用純水定容至刻度。從容量瓶中取出10 mL到50 mL離心管中,再加入40 mL無水乙醇,4500 r/min離心10 min棄除上清液,沉淀加80 %的乙醇約10 mL震蕩、離心,沉淀再同法重復(fù)洗滌2次。固體轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中用純水定容至刻度得不同pH值沉淀處理后制得的檢測液,同1.2.2、1.2.3方法檢測蛋白質(zhì)、粗多糖含量。

    1.2.10 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 在5個50 mL容量瓶中分別加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸,用1.2.9中制得的水解液定容至刻度,按1.2.7方法處理后,取離心后的清液10 mL到50 mL離心管中,再加入40 mL無水乙醇,以下步驟同1.2.9。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    (1)

    Xi:蛋白質(zhì)清除率(%);R1:試樣儲備液中蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg);R2:上述各方法除蛋白質(zhì)后計算為與R1同等體積中殘留蛋白質(zhì)的質(zhì)量(μg)。

    (2)

    Yi:多糖損失率(%);T1:試樣儲備液中粗多糖質(zhì)量(μg);T2:上述各方法除蛋白后檢測液中粗多糖計算為與T1同等體積中的剩余粗多糖質(zhì)量(μg)。

    精密度采用在重復(fù)性條件下獲得的二次獨立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10 %。以二次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值為結(jié)果表示。

    綜合指標(biāo)(Zi)參考文獻(xiàn)[16]作適當(dāng)修改。通過蛋白質(zhì)的清除率和多糖損失率加權(quán)重進(jìn)行評價考查。

    計算公式:Zi=(100-Yi)×0.5+Xi×0.5

    (3)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 堿性法

    取鼠曲草2 g加約50 mL水煮沸后離心,清液滴加碘溶液,不顯藍(lán)色,說明鼠曲草莖葉中不含淀粉,符合SN/T 4260標(biāo)準(zhǔn)檢測粗多糖含量要求。檢測得知鼠曲草干粉中粗多糖含量3.262 %,蛋白質(zhì)含量0.375 %。

    強(qiáng)堿可以裂解多糖與蛋白的連接鍵,同時利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的性質(zhì),沉淀去除多糖提取液中的堿性蛋白[12]。

    由表1可知,隨著溶液堿性的增強(qiáng),蛋白質(zhì)的清除率也逐漸增加,pH12的蛋白質(zhì)清除率比pH值11的增加3.52 %,但粗多糖損失率也增加2.55 %,綜合指標(biāo)(Zi)值僅增加0.49 %,堿性越強(qiáng)多糖糖苷鍵更易被破壞,建議pH不超過11。

    2.2 鹽酸酸法

    酸法與堿法的原理相似,是酸性蛋白質(zhì)由于等電點的作用而沉淀。酸性越強(qiáng)溫度越高多糖中糖苷鍵更易斷裂,造成多糖損失,采用酸法應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

    表1 堿性法檢測結(jié)果Table 1 The test results of alkaline process

    表2 酸性法檢測結(jié)果Table 2 The test results of acid process

    由表2可知,綜合指標(biāo)(Zi)最好的是pH值為4,最高蛋白質(zhì)清除率只有28.83 %,說明鼠曲草中的多數(shù)蛋白質(zhì)不是酸性蛋白,清除率較低,不建議用酸法去除鼠曲草粗多糖中的蛋白質(zhì)。

    2.3 醋酸鉛法

    重金屬鹽類與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性重金屬蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀析出,適合于蛋白質(zhì)含量較高的多糖溶液。

    由表3可知,醋酸鉛濃度為0.03 g/mL時,綜合指標(biāo)(Ze)考查最好,蛋白質(zhì)清除率達(dá)到97.55 %,是最佳條件。

    2.4 三氯乙酸法

    三氯乙酸法(Trichloroacetic acid,TCA)是根據(jù)蛋白質(zhì)在有機(jī)酸的作用下形成不可逆沉淀。一般操作方法是在多糖水溶液中滴加3 %等體積的TCA,混勻后靜置過夜,離心去除膠狀沉淀,重復(fù)以上的操作即可得到無蛋白的多糖溶液[12]。

    由表4可知,隨著三氯乙酸用量的增加,總體上蛋白質(zhì)的清除率和多糖的損失率都在升高。綜合指標(biāo)評價三氯乙酸濃度70 mg/mL時最好,比三氯乙酸濃度50 mg/mL提高1.23 %。由于三氯乙酸法脫蛋白質(zhì)時反應(yīng)較為劇烈,當(dāng)三氯乙酸濃度過高時會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致多糖降解分子變小,產(chǎn)生不期望的結(jié)果[13,15],建議三氯乙酸濃度控制在50~70 mg/mL。

    表3 醋酸鉛法檢測結(jié)果Table 3 The test results of lead acetate method

    表4 三氯乙酸法檢測結(jié)果Table 4 The test results of trichloroacetic acid method

    2.5 Sevag法

    Sevag法的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點進(jìn)行分離[17],雖然該方法條件溫和,是脫蛋白的經(jīng)典方法,但需要反復(fù)處理樣品多次,而且只能去除游離的蛋白質(zhì),對于與多糖緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)(糖蛋白)無法去除,除蛋白質(zhì)時變性的膠狀物會導(dǎo)致多糖損失[12]。

    由表5得知,Sevag法粗多糖的損失率都高于蛋白質(zhì)的清除率。氯仿∶正丁醇=4∶1重復(fù)5次的蛋白質(zhì)清除率為16.92 %,綜合指標(biāo)考查最好為47.89 %。氯仿∶正丁醇=5∶1的重復(fù)5次的蛋白質(zhì)清除率為7.72 %,綜合指標(biāo)考查最好為48.34 %,該方法不適用于鼠曲草粗多糖中去除蛋白質(zhì)。

    2.6 酶法

    酶的作用是使多糖提取液中蛋白質(zhì)水解生成小分子氨基酸,達(dá)到去除粗多糖中蛋白質(zhì)的目的。因為酶也是一種蛋白質(zhì),所以水解后還需用其它脫蛋白質(zhì)和脫氨基酸方法除去酶和氨基酸。為此考查了木瓜蛋白酶處理后再用堿性法、三氯乙酸法除去木瓜蛋白酶,用80 %乙醇洗滌除去氨基酸的效果。

    2.6.1 木瓜蛋白酶—堿性法 由表6與表1比較可知,酶—堿法處理后去除蛋白質(zhì)效果好于單用堿處理的方法。pH值9時綜合指標(biāo)最高,達(dá)到79.48 %,與pH值10、pH值11分別只相差0.51 %、0.95%,所以該法pH要控制在9~11。

    表5 Sevag法檢測結(jié)果Table 5 The test results of Sevag method

    注:a表示氯仿∶正丁醇=4∶1;b表示氯仿∶正丁醇=5∶1。
    Note:ashowed Chloroform ∶ N-butanol = 4∶1 (Vol);bshowed Chloroform ∶ N-butanol = 5∶1 (Vol).

    表6 木瓜蛋白酶—堿性法檢測結(jié)果Table 6 The test results papain-alkaline method

    2.6.2 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 三氯乙酸有終止木瓜蛋白酶的作用[18]。由表7可知,木瓜蛋白酶—三氯乙酸法除去鼠曲草中的蛋白質(zhì)較為徹底。但粗多糖的損失率整體都很高,從綜合指標(biāo)考查,建議三氯乙酸濃度要小于5 mg/mL。

    2.7 8種方法中最優(yōu)效果比較

    8種方法最優(yōu)效果比較見圖1。

    表7 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法檢測結(jié)果Table 7 The test results of papain-trichloroacetic acid method

    3 討 論

    謝麗源等比較了Sevag法和三氯乙酸法去除桑黃多糖提取液中蛋白質(zhì)的情況,結(jié)果顯示三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于Sevag法[19],與我們的結(jié)果一致。多糖主要有兩種存在形式,一種是單糖由苷鍵鏈接形成的多糖,另一種是由糖鏈與肽鏈結(jié)合形成的糖蛋白。三氯乙酸法、堿法、酸法都存在破壞糖苷鍵或改變活性的可能,濃度需盡可能的低。醋酸鉛法存在去除糖蛋白的可能。蛋白酶法是否對糖蛋白有水解作用需進(jìn)一步的研究。所以在去除蛋白質(zhì)的過程中要充分考慮多糖的存在形式和希望得到的多糖形式。

    1:堿法(pH=13);2:堿法(pH=4);3:醋酸鉛法(0.03 g/mL);4:三氯乙酸法(6.54 %);5:Sevag法(4∶1)5次;6:Sevag法(5∶1)5次;7:酶-氫氧化鈉法(pH=9);8:酶-三氯乙酸法(0.5 %)圖1 8種方法中最優(yōu)效果的比較Fig.1 Comparison of the best effects of the 8 methods

    從圖1可見,提取鼠曲草粗多糖去除蛋白質(zhì)效果排序是醋酸鉛法>三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—氫氧化鈉法>氫氧化鈉法>鹽酸法 >Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)>Sevag法(氯仿∶正丁醇=5∶1)。其中醋酸鉛法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶—三氯乙酸法效果較好,可依據(jù)鼠曲草粗多糖提取純化目的要求進(jìn)行選擇。Sevag法、堿法、酸法不建議采用。從醋酸鉛法和木瓜蛋白酶—三氯乙酸法的結(jié)果比較推測,鼠曲草中的粗多糖主要由單糖構(gòu)成。

    4 結(jié) 論

    上述8種鼠曲草去除蛋白質(zhì)的方法中。木瓜蛋白酶—三氯乙酸法蛋白質(zhì)清除率可達(dá)到100 %,但粗多糖損失率也較高,適用于蛋白質(zhì)含量要求低的粗多糖分離。醋酸鉛法蛋白質(zhì)清除率可達(dá)到97 %,粗多糖損失率相對較低,適用于量較大的粗多糖的提取分離。

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