棉花胞質(zhì)雄性不育細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性的研究

李玉青，王清連，韋春艷，董 濤,陳全家，周瑞陽

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000;2.河南科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】陸地棉是異源四倍體，世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，也是研究多倍體作物的模型[1-2]。隨著經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展，人們對棉花育種的綜合優(yōu)良品質(zhì)提出了更高的要求，培育高產(chǎn)是植棉效益的基礎(chǔ)，也是棉花育種的主要目標(biāo)[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)為提高作物產(chǎn)量提供了一個(gè)優(yōu)越的育種系統(tǒng)，CMS作為質(zhì)-核互作雄性不育能通過“三系”雜交育種應(yīng)用于生產(chǎn)，農(nóng)作物通過雜種優(yōu)勢可以大型商業(yè)化生產(chǎn)F1雜交種子[4-5]。冀FRH3018、中棉所83的選育都是通“三系法”協(xié)同改良篩選出符合育種目標(biāo)的棉花新品種[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)以細(xì)胞質(zhì)雄性不育系C2P5A、保持系C2P5B為材料，觀察不育系C2P5A雄性敗育發(fā)生的時(shí)期和特點(diǎn)；測定生理生化指標(biāo)的含量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探尋C2P5A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的原因，為棉花雜種優(yōu)勢的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不育系C2P5A，保持系C2P5B。2018年種植于河南科技學(xué)院棉花研究試驗(yàn)田地，按照常規(guī)方法進(jìn)行田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花器官觀察以及花粉?；盍y定 在C2P5A不育株和可育株盛花期時(shí)，觀察各株的花器官，在掃描儀上觀察并拍照，花粉粒活力測定采用TTC染色，對兩系進(jìn)行育性鑒定。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取花藥的不同發(fā)育時(shí)期：小孢子母細(xì)胞時(shí)期(花蕾縱徑3～4.0 mm)、四分體時(shí)期(花蕾縱徑4.1～5.5 mm)、單核時(shí)期(花蕾縱徑5.6～6 mm)、雙核時(shí)期(花蕾縱徑6.1～8 mm)，成熟的花粉粒時(shí)期 (花蕾縱徑8.1～10 mm)， 花蕾縱徑(從蜜腺到花蕾頂端的長度,mm)。用FAA固定液固定，石蠟切片分析花藥的細(xì)胞形態(tài)學(xué)，按照常規(guī)程序進(jìn)行石蠟切片，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠雙重染色，生物學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測定 取花蕾、花朵和葉片進(jìn)行測定。花蕾的3個(gè)時(shí)期：小孢子母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期、雙核時(shí)期，所測樣品均以鮮重計(jì)?？扇苄蕴?、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)測定參考高俊風(fēng)主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[8]，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、脯氨酸測定參照王三根植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[9]；改良半葉片法測定光合速率[10]，所有指標(biāo)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，生理生化指標(biāo)含量利用酶標(biāo)儀TECHSPARK10M測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 花器形態(tài)特征及花粉粒TTC活力測定

不育株與保持株花器形態(tài)上有很明顯的差異，主要表現(xiàn)為不育系的整個(gè)花朵較保持系的小(圖1-A)。包葉片小，花瓣小(圖1-B)。不育系花柱裸露(圖1-C)。不育系花絲明顯比保持系短，沒有花粉，在生長發(fā)育過程中可能出現(xiàn)褐化死亡(圖1-D)。花粉粒經(jīng)過2 % TTC染色，不育系的花粉粒干癟，形態(tài)大小不均勻，多數(shù)不著色或著色淺，活力明顯弱于保持系；保持系花粉粒飽滿，大小均勻，染色著色深(圖1-E)。

圖1 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系花器形態(tài)結(jié)構(gòu)及花粉?；盍ig.1 The morphological structure and pollen grain vigor of CMS line and its maintainer

A～E為保持系花藥，F(xiàn)～J為不育系花藥。A、F為小孢子母細(xì)胞時(shí)期×400；B、G為四分體時(shí)期×400；C、H為小孢子單核時(shí)期×200；D、I為雙核時(shí)期×200；E、J為成熟的花粉粒時(shí)期×200。MMC為小孢子母細(xì)胞；T為絨氈層； ML為中層；EN為藥室內(nèi)壁；E為表皮層；Tds為四分體；DMMC為降解的小孢子母細(xì)胞；Ms為小孢子；CDMMC為完全降解的小孢子母細(xì)胞；DT為降解的絨氈層；ET為完整的絨氈層； CT為致密的絨氈層；AAs為敗育的花粉囊；AS為敗育的花藥；Pg為花粉粒；MPg為成熟的花粉粒圖2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系不同時(shí)期花藥觀察Fig.2 Observed anthers from CMS line and its maintainer at different developmental stages

2.2 花藥不同發(fā)育時(shí)期的顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1 小孢子母細(xì)胞時(shí)期 保持系花藥壁從外到內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層4層組成，排列規(guī)則，能清晰觀察到中層細(xì)胞核，絨氈層細(xì)胞核大染色深；4層細(xì)胞圍繞在小孢子母細(xì)胞周圍(圖2-A)。不育系花藥壁也有4層組成，但是它們的形狀差別不大，特別是絨氈層細(xì)胞，體積及著色與其它藥壁細(xì)胞相差不明顯(圖2-F)。

2.2.2 四分體時(shí)期 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體，保持系四分體時(shí)期的四層細(xì)胞有了顯著差異，中層的細(xì)胞變得窄小，絨氈層細(xì)胞再進(jìn)行發(fā)育，體積變大，細(xì)胞核變大、染色加深，并緊密圍繞在小孢子四分體周圍(圖2-B)。不育系絨氈層沒有發(fā)育還是整體在一起，并且與其它層緊密粘在一起，不育系小孢子母細(xì)胞開始解體(圖2-G)。

2.2.3 小孢子單核時(shí)期 保持系絨氈層分泌胼胝質(zhì)酶，降解圍繞四分體周圍的胼胝質(zhì)，釋放出單核小孢子，此時(shí)，絨氈層也開始解離提供營養(yǎng)(圖2-C)。不育系小孢子母細(xì)胞完全解體與絨氈層連在一起，并形成致密的絨氈層(圖2-H)。

2.2.4 雙核及花粉粒成熟時(shí)期 保持系絨氈層降解(圖2-D)，被釋放的單核小孢子作為營養(yǎng)吸收，單核小孢子發(fā)育成雙核的花粉粒，并且成熟的花粉粒表面有刺突，絨氈層完全降解(圖2-E)。不育系絨氈層薄壁細(xì)胞擴(kuò)增，填充花粉囊，最終花粉囊內(nèi)沒有花粉粒的產(chǎn)生(圖2-I)。

2.3 生理生化指標(biāo)測定結(jié)果比較與分析

2.3.1 雄性不育系與保持系可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的比較 可溶性糖為花藥發(fā)育及各物質(zhì)合成提供能量和原料。從隨著花藥的發(fā)育，不育系和保持系花藥中的可溶性糖含量都逐漸遞增(3-A)，且在花朵中都達(dá)到最高值，另外在花藥發(fā)育的各時(shí)期中，保持系花藥中的可溶性糖含量都高于不育系花藥，在四分體時(shí)期、雙核時(shí)期達(dá)到顯著差異，花朵中二者的可溶性糖含量達(dá)到極顯著差異。

可溶性蛋白質(zhì)含多種氨基酸，為細(xì)胞發(fā)育提供保護(hù)。從圖3-B中看出，不育系可溶性蛋白質(zhì)的含量在花藥發(fā)育各時(shí)期、花朵及葉片中都低于保持系，在花藥的四分體時(shí)期、雙核時(shí)期都達(dá)到極顯著差異，花朵中達(dá)到顯著差異。

脯氨酸(Pro)參與植物體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)，是作物育種的一個(gè)重要生理指標(biāo)，在逆境脅迫條件下，脯氨酸可以大量積累來對抗逆境脅迫如干旱、鹽漬、寒冷等。脯氨酸的含量在保持系花藥發(fā)育時(shí)期、花期一直遞增(圖3-C)，在雙核時(shí)期、花朵中二者含量的差異達(dá)到極顯著差異，葉片中的含量二者達(dá)到顯著差異。

2.3.2 雄性不育系與保持系CAT活性、POD活性、MDA含量及光合速率的比較 過氧化氫酶(CAT)可以清除生物體內(nèi)的過氧化氫(H2O2)，避免遭受H2O2的毒害。從圖4-A看出，隨著花藥的發(fā)育， CAT活性在不育系、保持系中均呈現(xiàn)下降的趨勢，且在花朵中達(dá)到最低值；在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，CAT活性都達(dá)到最高值，保持系高于不育系，差異達(dá)到極顯著水平；在四分體時(shí)期、雙核時(shí)期CAT活性不育系高于保持系分別達(dá)到極顯著差異、顯著差異；葉片中CAT活性不育系高于保持系差異達(dá)到極顯著水平。

I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別表示葉片、小孢子母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期、雙核時(shí)期、花朵。下圖相同注釋。各圖中小寫字母代表0.05下差異，達(dá)到顯著水平；大寫字母代表0.01下差異，達(dá)到極顯著水平；沒有字母標(biāo)記代表差異小，不顯著圖3 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系葉片、花藥發(fā)育、花中可溶性糖(A)、可溶性蛋白含量(B) 及脯氨酸含量(C)Fig.3 CMS lines and maintainer lines leaves, anther development stage and flowers of soluble sugar content(A)，soluble protein content(B) and proline content (C)

作為膜脂過氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)，它能加劇細(xì)胞膜的損傷，所以了解膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性可以測定MDA。從圖4-B可以看出，花藥發(fā)育過程中，在不育系、保持系中MDA含量都逐步降低，但在同時(shí)期不育系的含量始終高于保持系；葉片中MDA含量不育系低于保持系。

過氧化物酶(POD)具有消除過氧化氫和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用。圖4-C顯示，花藥發(fā)育時(shí)期，不育系的POD活性總體呈現(xiàn)下降趨勢；在小孢子母細(xì)胞時(shí)期及葉片中不育系的POD活性高于保持系，差異達(dá)到極顯著水平，而在花朵中不育系的POD活性低于保持系，達(dá)到顯著差異。

光合速率是植物光合效率的重要指標(biāo)，光合速率越高，碳水化合物產(chǎn)生的越多。圖4-D顯示，在同等條件下，不育系的光合速率極顯著低于保持系的光合速率。

3 討 論

3.1 雄性不育系敗育時(shí)期

研究[11-13]表明棉花不育系的敗育時(shí)期主要發(fā)生在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，在減數(shù)分裂過程中解體。劉記等[14]研究新型光敏不育系，花藥的敗育主要發(fā)生小孢子單核后期；吳元龍[15]在研究不育系1355A觀察到敗育在小孢子時(shí)期，小孢子萎縮變形，花粉外壁沒有棘突。

本試驗(yàn)石蠟切片觀察到不育系的絨氈層細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞時(shí)期較之保持系著色淺，在四分體時(shí)期較之保持系沒有進(jìn)行發(fā)育，導(dǎo)致不育系小孢子母細(xì)胞在進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)沒有得到絨氈層營養(yǎng)的供給，不能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，開始解體。

3.2 雄性不育與花藥部分物質(zhì)代謝的關(guān)系

小孢子發(fā)育過程中需要大量的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)作為生長發(fā)育的基礎(chǔ)，周國昌等[16]花藥發(fā)育過程中提出“物質(zhì)虧損”，認(rèn)為營養(yǎng)供應(yīng)不足，導(dǎo)致小孢子異常發(fā)育。

本實(shí)驗(yàn)研究表明隨著花藥的發(fā)育，可溶性糖含量在不育系中都低于同時(shí)期的保持系，光合速率顯著低于保持系，二者相吻合，即保持系產(chǎn)生的碳水化合物糖類高于不育系；花藥發(fā)育時(shí)期，可溶性蛋白質(zhì)的含量在不育系中都低于同時(shí)期的保持系，特別在四分體時(shí)期、雙核時(shí)期含量極顯著低于保持系，表明營養(yǎng)供應(yīng)不足，是導(dǎo)致雄性不育的重要原因之一；脯氨酸含量在不育系中幾乎都低于同時(shí)期的保持系，特別在雙核時(shí)期、花朵中都達(dá)到極顯著差異，這也是導(dǎo)致不育系花藥發(fā)育瘦弱，褐化死亡，抗逆性差的原因，這些生理代謝異常都是造成小孢子母細(xì)胞敗育的原因。

各圖中小寫字母代表0.05下差異，顯著水平；大寫字母代表0.01下差異，極顯著水平；沒有字母標(biāo)記代表差異小，不顯著圖4 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系葉片、花藥發(fā)育、花期CAT活性(A)、MDA含量(B)、POD活性(C)及光合速率(D)Fig.4 CMS lines and maintainer lines leaves,anther developments tage and flowers of CAT activity(A),MDA content(B),POD activity(C) and Photosynthetic rate (D)

3.3 雄性不育系與花藥抗氧化系統(tǒng)中關(guān)鍵酶活性的關(guān)系

劉莉等[17]在水稻上的研究表明，在敗育前期， CAT酶活性降低，不能及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生的有害自由基，造成自由基累積，致使膜脂過氧化作用加劇，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，在敗育前， CAT活性不育系顯著低于保持系，對細(xì)胞造成毒害作用。

本試驗(yàn)POD活性不育系在敗育前比保持系高，這與周仲華等[18]對棉花不育系的研究相一致，植物體內(nèi)POD活性升高會促使生長素氧化分解，花藥所需要的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足，另外造成花序中乙烯大量積累，造成細(xì)胞衰老，引起花藥敗育。

MDA在生物有機(jī)內(nèi)活性氧毒害的指標(biāo)，周仲華等研究表明植物體內(nèi)含有較高的MDA是造成膜脂過氧化增強(qiáng)，造成敗育的重要原因[18]。本試驗(yàn)不育系花藥中膜脂過氧化產(chǎn)物的MDA含量高于保持系，活性氧毒害的程度較高，使細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞或損傷，造成細(xì)胞內(nèi)生理代謝紊亂，引起棉花雄性敗育。

4 結(jié) 論

棉花細(xì)胞質(zhì)不育系C2P5A與對照保持系比較，在花藥石蠟切片中觀察到不育系敗育可能有以下兩個(gè)原因，一絨氈層發(fā)育異常，不能及時(shí)提供營養(yǎng)給小孢子母細(xì)胞，造成敗育；二絨氈層內(nèi)部的薄壁細(xì)胞徑向伸長，填充整個(gè)花藥，花粉粒不能形成，造成敗育。

測定生理生化指標(biāo)，找出不育系形成敗育的原因，其一可溶性糖、可溶性蛋白在不育系中的含量比同時(shí)期保持系低，造成不育系營養(yǎng)供應(yīng)不足，使小孢子母細(xì)胞分化受阻，此分析與石蠟切片不育系絨氈層沒有發(fā)育，營養(yǎng)供應(yīng)不足造成敗育相一致；其二MDA在不育系中的含量比同時(shí)期保持系高，活性氧對不育系的細(xì)胞膜造成傷害；在敗育前，CAT活性過低，不能及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生的有害自由基，致使活性氧毒害作用加劇，以上都是造成不育系敗育的原因。