人CDK9基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合蛋白的生物信息學(xué)分析

蔡潔怡，朱其偉，宗陳雨，劉洪鑫，高兢望，王宇蝶，杜冠魁*

（1.海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，海南 海口 571199；

2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，海南 ?？?571199）

細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）不僅可以對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，有部分CDKs也可以調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶9（CDK9）是組成正相轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）催化活性中心的絲氨酸/蘇氨酸激酶[1]。CDK9作為P-TEFb的一部分，通過(guò)磷酸化RNA聚合酶II（RNAPII）的CDT第二位絲氨酸，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸[2]。在mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，由于負(fù)性轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)錄延伸因子（NELF）和DRB敏感誘導(dǎo)因子（DSIF）的阻礙作用，RNAPII在合成一小段mRNA后隨即暫停在啟動(dòng)子區(qū)[3]，讓mRNA擁有足夠的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)加帽過(guò)程。加帽完成后，CDK9被招募到暫停的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上，磷酸化NELF的E亞基，DSIF的Spt5亞基[4-5]，解除二者對(duì)RNAPII的抑制作用；在此期間，他們?yōu)榱薽RNA的合成能夠有效進(jìn)行，通過(guò)在RNAPII的C末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行磷酸化，繼而讓RNAPII于暫停點(diǎn)釋出。CDK9的活性依賴于與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白亞基（cyclin T1，T2a和T2b）結(jié)合，并進(jìn)一步通過(guò)與其他大分子交聯(lián)進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前，發(fā)現(xiàn)有兩種CDK9，分別為42kD和55kD，在不同類型細(xì)胞的不同細(xì)胞周期中，它們的表達(dá)受到調(diào)控。發(fā)現(xiàn)通過(guò)siRNA沉默CDK9的表達(dá)，可下調(diào)Myc的表達(dá)引起的HCC異常增殖，確認(rèn)了CDK9為治療HCC的靶標(biāo)[6]。

1 材料與方法

1.1 人CDK9基因5’調(diào)控區(qū)序列的獲得

在GeneBank上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)里檢測(cè)人CDK9 cyclin-dependent kinase 9[Homo sapiens(human)]基因(Gene ID：1025)，把轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)作為截取區(qū)間，也就是將基因組序列中的上游2000 bp至下游200bp這2200 bp(-2000 bp～+200 bp)當(dāng)作CDK9基因5’調(diào)控區(qū)，分析該序列。

1.2 CDK9基因5’調(diào)控區(qū)序列上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

使用JASPAR軟件(http：//jaspar.genereg.net/)對(duì)CDK9基因5’調(diào)控區(qū)序列上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)在線分析進(jìn)行預(yù)估，參數(shù)設(shè)定如下：選取脊椎動(dòng)物核心數(shù)據(jù)庫(kù)(JASPAR Core Vertebrata)，Number of matrices選擇200，Type選擇Within each matrix，Relative profile score threshold選擇85%、90%、95%和100%。

2 結(jié) 果

相對(duì)剖面分?jǐn)?shù)閾值在85%～100%時(shí)，通過(guò)在線軟件JASPAR在網(wǎng)上對(duì)CDK9基因啟動(dòng)子潛在的所測(cè)得的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)依次是2365、686、185和13個(gè)。其中Relative profile score threshold在100%的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果位點(diǎn)如表1所示，包括因子ELK4（ETS-domain protein (SRF accessory protein 1)），Gabpa (GA binding protein transcription factor alpha subunit)，Gata1(GATA binding protein 1)，MZF1(myeloid zinc finger 1)，Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)，Prrx2(paired related homeobox 2)，SPI1(Spi-1 proto-oncogene)，ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)。

表1

3 討 論

CDK9與Cyclin T1組成異二聚體激酶P-TEFb，于所有的真核生物中都可以檢測(cè)到。經(jīng)研究表明：基因轉(zhuǎn)錄從起始階段進(jìn)入有效延伸階段需要P-TEFb因子，艾滋病，心肌肥大和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與其有緊密聯(lián)系。

到底有哪些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件能夠在CDK9基因的表達(dá)調(diào)控中產(chǎn)生作用以及產(chǎn)生哪些作用，上調(diào)或者下調(diào)CDK9基因的表達(dá)。在現(xiàn)代分子生物學(xué)基因表達(dá)調(diào)控理論中，我們可以認(rèn)識(shí)到，上調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵決定于有無(wú)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和哪類性質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與其互相影響，所以，首要的是找到某些轉(zhuǎn)錄文件，在CDK9基因的表達(dá)中發(fā)揮決定性作用。然而，關(guān)于CDK9基因的轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控鮮有報(bào)道。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CDK9基因啟動(dòng)子上具有多個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點(diǎn)，包括因子ELK4，Gabpa，Gata1，MZF1，Pdx1，Prrx2，SPI1，ZEB1。在轉(zhuǎn)錄因子ETS家族、三元復(fù)合因子(TCF)亞族中，可以檢測(cè)到ELK4。ELK4通過(guò)與ELK1和ELK結(jié)合形成三元復(fù)合物，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[7]。Gabpa是承擔(dān)與DNA結(jié)合任務(wù)的GA結(jié)合蛋白(GA-binding protein，GABP)NRF-2中的α亞基。NRF-2參與激活線粒體呼吸鏈蛋白組分的表達(dá)，如琥珀酸脫氫酶，細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C氧化酶，ATP合成酶等；對(duì)線粒體復(fù)制因子（Replication factor）和轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，像人類線粒體轉(zhuǎn)錄因子B(mitochondrial transcription factor B，TFBM)；人類蛋白線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)；對(duì)線粒體運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如線粒體外膜的移位酶(translocase outer mitochondrial membrane，TOMM)；調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，如參與自由基代謝的Mpv17-like protein，抗氧化蛋白(peroxiredoxins，PRDXs)，DNA修復(fù)酶8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1)。于在早期紅系細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、非造血胚胎干細(xì)胞及睪丸基質(zhì)Sertoli細(xì)胞中出現(xiàn)很多GATA。在紅細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中，GATA發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，且跟巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的分化有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子GATA-1可以和許多生物大分子柜互作用，如紅細(xì)胞生成素（EPO）、FOG（friend of GATA）、GATA-2等，在thrombocytopenia、MM、Leukocythemia等疾病發(fā)病中發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。Pdx-1是參與包括胰島素基因在內(nèi)的多個(gè)β細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄的主控轉(zhuǎn)錄因子。生理方面，Pdx-1參與了胰腺的發(fā)育和分化，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、成熟和功能的維持[11]；病理方面，除了Pdx-1的基因變異與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)外，還發(fā)現(xiàn)Pdx-1在包括胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，且認(rèn)為Pdx-1在腫瘤細(xì)胞中有促增殖效應(yīng)，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及對(duì)化療的耐藥有關(guān)。SPI1轉(zhuǎn)錄因子屬于保守的DNA結(jié)合蛋白Ets家族中成員之一，因其DNA結(jié)合區(qū)識(shí)別共有序列GAGGAA，故該區(qū)又稱為Ets結(jié)合區(qū)。SPI1主要在造血系統(tǒng)如髓細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)節(jié)關(guān)鍵髓系基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控造血系統(tǒng)的分化。ZEB1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，已被確認(rèn)為EMT的一個(gè)誘導(dǎo)劑。在浸潤(rùn)性實(shí)體腫瘤中，ZEB1是一個(gè)通過(guò)抑制E-鈣粘素轉(zhuǎn)錄基因編碼的EMT關(guān)鍵誘導(dǎo)物。ZEB1在惡性腫瘤的發(fā)生、病程進(jìn)展中起到了推動(dòng)作用。目前仍需通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)和9深入探討CDK9基因的表達(dá)調(diào)控和具體疾病是否存在直接或間接的聯(lián)系。

CDK9在人類惡性腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過(guò)抑制CDK9基因的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可以在腫瘤的治療中探索出新的治療手段。根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)位于CDK9基因啟動(dòng)子區(qū)，如果我們能夠干擾CDK9基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，下調(diào)CDK9的表達(dá)，也能為抗腫瘤分子靶向藥物的進(jìn)一步發(fā)展提供新的方案或治療靶點(diǎn)。惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的特別重要的一個(gè)因素，我們通過(guò)研究CDK9的表達(dá)作用，可以更好地推動(dòng)腫瘤治療方案的改進(jìn)，從而進(jìn)一步改善腫瘤患者的預(yù)后，更大程度上提高接受治療后的生活質(zhì)量。