白芨塊莖cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組序列分析

王 宇，楊文麗，李嘉鈺，向雪靜，李月萍，蔡佳麗

（1.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川攀枝花617000）

白芨是多年生草本植物，屬于蘭科白芨屬。主要分布在云南、四川、貴州、湖南、湖北、江西等省，多生長在海拔高度為950-3500 m的闊葉林下。白芨及其塊莖是我國藥典記錄的傳統(tǒng)中藥材之一，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，其塊莖中含有較豐富的芐類、萜類和多糖類化學(xué)成分，具有止血潤肺、消腫生肌、抗氧化、清除自由基、預(yù)防心血管疾病、抗菌和抗腫瘤等功效，在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用［1-4］。

目前，通過構(gòu)建cDNA文庫和高通量轉(zhuǎn)錄組測序，已對多種藥用植物進(jìn)行分子生物學(xué)研究，挖掘出了一些重要功能基因，對于揭示不同生物學(xué)性狀的分子機(jī)制具有重要意義［5］。

本研究采用高通量測序技術(shù)對白芨塊莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，得到白芨的重要功能基因，對其進(jìn)行功能注釋、分類和代謝通路分析，這為下一步研究白芨的藥用成分、次生代謝等機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

植株由攀枝花市豐盛源農(nóng)林開發(fā)有限公司提供。

1.1.2主要儀器與試劑

凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀購于美國伯樂公司、超微量核酸分析儀購于杭州奧盛儀器有限公司、RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1RNA提取

按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA，使用凝膠電泳和超微量核酸分析儀對其質(zhì)量和濃度進(jìn)行分析。

1.2.2cDNA文庫的構(gòu)建

首先用磁珠富集poly（A）mRNA，然后以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA和第二鏈cDNA，對雙鏈cDNA進(jìn)行純化后再進(jìn)行末端修復(fù)、加尾和加接頭，片段分選以及PCR擴(kuò)增，最后構(gòu)建成cDNA文庫，對文庫質(zhì)檢后進(jìn)行測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行處理，得到有效數(shù)據(jù)（Unigene序列），再將獲得的Unigene序列與SwissProt、Nr、GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得功能注釋，推測基因的功能與作用。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝分析

測序得到5624755條序列，經(jīng)過組裝得到130721條Unigene，N50長度為1490 bp，最短序列長度為201 bp，最長序列長15579 bp，平均長度為802 bp。在130721條Unigene中，76239條在200-500bp之間，占58.32%；21645條在500-1000 bp之間，占16.56%；11919條在1000-1500bp之間，占9.12%；8234條在1500-2000 bp之間，占6.30%；12683條大于2000bp，占9.70%（圖1）。

圖1 Unigene不同長度區(qū)間分布

圖2 Unigene在各數(shù)據(jù)庫注釋分布

2.2 Unigene注釋

將130721條Unigene序列通過NR、COG、Swissprot、KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，60827條Unigene獲得注釋。60033條Unigene在NR數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占45.92%，30267條Unigene在COG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占23.15%；39368條在Swissprot數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占30.12%；8252條在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占6.31%，見圖2。

2.3 Unigene的GO分類

25820條Unigene得到GO功能注釋，共分為54個(gè)小類，其中生物進(jìn)程、有19個(gè)小類，主要有：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞調(diào)控、細(xì)胞自噬、生物調(diào)控、刺激反應(yīng)、繁殖進(jìn)程等；分子功能有22個(gè)小類，主要有：結(jié)構(gòu)分子活性、運(yùn)輸活性、催化活性、營養(yǎng)儲存活性、抗氧化活性、與蛋白質(zhì)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性、分子功能調(diào)控等；細(xì)胞組分有13個(gè)小類，主要有：細(xì)胞膜、突觸部分、細(xì)胞外基質(zhì)、大分子復(fù)合體等。

2.4 Unigene的COG分類

COG數(shù)據(jù)庫是由NCBI創(chuàng)建并維護(hù)的蛋白數(shù)據(jù)庫，通過比較大量生物的蛋白質(zhì)序列對基因產(chǎn)物進(jìn)行同源分類。將Unigene通過COG數(shù)據(jù)庫后進(jìn)行分類，可以分為RNA加工和修飾、細(xì)胞周期控制、防御機(jī)制等不同功能，詳見圖3。

圖3 Unigene的COG功能分類

2.5 Unigene的KOG分類

30267條Unigene得到GO功能注釋，可分為26類；其中參與“一般功能預(yù)測”（General function prediction only）的轉(zhuǎn)錄物最多，有4286個(gè)，占 14.16%；第二為參與“信號傳導(dǎo)機(jī)制”（Siganl transduction mechanisms）的轉(zhuǎn)錄物，有3733個(gè)，比例為12.33%。此外，還包括核酸運(yùn)輸代謝、RNA組裝修飾、糖類運(yùn)輸代謝、輔酶運(yùn)輸代謝、脂類運(yùn)輸代謝、能量生產(chǎn)轉(zhuǎn)化等多數(shù)生理生化過程。

2.6 KEGG代謝分析

KEGG代謝途徑分析表明，1916條Unigene參與了葡萄糖、果糖、半乳糖等多種糖類代謝，1320條Unigene參與了多種氨基酸代謝；185條Unigene參與了萜類和酮類化合物的代謝，此外，參與脂類、核酸、能量等代謝類型的Unigene有9194條；1147條Unigene參與了各種細(xì)胞和組織系統(tǒng)（如運(yùn)輸與分解代謝）進(jìn)程，4259條Unigene參與了遺傳物質(zhì)（如折疊、分類和降解）和環(huán)境信息（如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）的處理和加工過程。

2.7 白芨多糖的關(guān)鍵酶

白芨膠質(zhì)的主要成分為白芨多糖，以葡萄糖和甘露聚糖為主，找到相關(guān)合成的酶基因，有利于闡明白芨膠質(zhì)多糖的生物合成與分解途徑。本研究發(fā)現(xiàn)了有關(guān)白芨多糖合成的多個(gè)酶基因，如β-葡萄糖苷酶、β-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、α-甘露糖苷酶、磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶等，這些酶基因都參與了糖代謝途徑。

2.8 微衛(wèi)星DNA序列分析

微衛(wèi)星DNA序列就是簡單重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物的基因中，可以作為優(yōu)良的遺傳標(biāo)記。在白芨中發(fā)現(xiàn)39585個(gè)星位點(diǎn)，以單核苷酸、雙核苷酸和三核苷酸三種類型為主，單核苷酸的基序?yàn)锳/T/C，二核苷酸基序?yàn)锳T/AG/CT，三核苷酸的基序?yàn)門TC/ATC/CGG。

3 討論

白芨塊莖含有豐富的多糖，具有誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)、增強(qiáng)天然殺傷性細(xì)胞活性等免疫功能，因此可以開發(fā)為抗腫瘤藥物或者化妝品添加物［6］。此外，白芨塊莖中含有萜類、甾類以及聯(lián)芐類物質(zhì)，研究表明白芨萜類及其衍生物具有抗血管生成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。目前，將白芨的化學(xué)成分和藥理研究結(jié)合起來，對研制新藥具有廣闊的應(yīng)用前景［7］。

本研究通過對白芨的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，找到了大量參與白芨多糖和萜類合成與代謝相關(guān)的基因，這為研究白芨的藥用成分、次生代謝具有重要意義。同時(shí)，通過對微衛(wèi)星DNA序列分析可為白芨的遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。