腎臟去細(xì)胞和再生研究進(jìn)展

黎婷

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

0 引言

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）及其并發(fā)癥對(duì)人類和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重威脅，全球CKD成年患病率在13%左右。CKD不斷進(jìn)展將導(dǎo)致終末期腎臟疾病，甚至其它器官功能也會(huì)衰退。CKD中腎癌的發(fā)病率和死亡率在全身腫瘤中占2%［1］，切除腎臟及其周圍組織是目前被廣泛應(yīng)用于腎癌臨床治療的的一種方法，但對(duì)于單側(cè)腎、雙腎腫瘤、以及對(duì)側(cè)腎臟受損等患者來說，行切除術(shù)會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)面后果。腎移植可從根本上治療腎臟實(shí)質(zhì)損傷，但是供體嚴(yán)重缺乏等問題很難取得實(shí)質(zhì)性突破，這些問題促使了腎再生修復(fù)工程的迅速發(fā)展。一種解決方法是利用干細(xì)胞治療，研究發(fā)現(xiàn)，出生后哺乳動(dòng)物的腎部分切除后的修復(fù)，可能是腎的干細(xì)胞遷移到受傷區(qū)域，增殖分化成體細(xì)胞，但腎的構(gòu)成極為復(fù)雜，限制了臨床再生治療的發(fā)展［2］；另一種解決器官短缺的方法是使用動(dòng)物器官進(jìn)行異種移植，將動(dòng)物器官去細(xì)胞后接種患者細(xì)胞，可避免免疫排斥反應(yīng)，豬腎制成的去細(xì)胞支架，與猴及狗制成的腎支架相比，細(xì)胞的粘附性、生存和增殖效果好，但是應(yīng)用到臨床腎再生治療上仍有待完善［3］。

1 組織再生學(xué)

終末期腎病患者的增多、器官供體的短缺、異種移植的臨床實(shí)施性等問題，促進(jìn)了組織再生學(xué)的發(fā)展。組織再生學(xué)中重建一個(gè)新組織需要三大元素：種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子。臨床目前應(yīng)用于組織工程中的支架材料分為三類：化學(xué)合成支架、天然成分支架和納米三維支架，但是存在著組織相容性和細(xì)胞粘附性差等問題。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了全器官去細(xì)胞支架，能最大程度的保留臟器的大體形態(tài)、天然的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和超微結(jié)構(gòu)，因其具有良好的生物安全性和生物相容性，以及具有細(xì)胞識(shí)別及黏附位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛用作組織工程支架材料。完整的天然ECM，比如真皮、心包、小腸和膀胱等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于外科再建手術(shù)，因其保存了葡糖氨基聚糖類（GAGs）和纖維蛋白（如膠原蛋白、彈性蛋白和層黏連蛋白等），可維持三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)供種子細(xì)胞附著，并存在著一些復(fù)合生長(zhǎng)因子，可通過信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)基因表達(dá)來誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等［4］。ECM與種子細(xì)胞之間“動(dòng)態(tài)互動(dòng)”，這對(duì)腎組織的再生與修復(fù)有著重要的意義［5］。

腎的解剖結(jié)構(gòu)和組成極為復(fù)雜，制備全腎去細(xì)胞支架除了保存天然立體結(jié)構(gòu)外，還要保留其過濾功能的顯微結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，腎ECM支架移植后，可促進(jìn)血管發(fā)生，募集循環(huán)的祖細(xì)胞、免疫排斥性最小化，還能減少疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)［6］。2009年，我國劉春曉［7-8］首次制備出大鼠全腎去細(xì)胞支架；近十年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)全腎去細(xì)胞生物支架進(jìn)行的初步細(xì)胞培養(yǎng)驗(yàn)證了支架的組織相容性，再細(xì)胞化后檢測(cè)腎功能，為腎的再生修復(fù)工程奠定了基礎(chǔ)［9］。

1.1 全器官去細(xì)胞支架制備方法和影響因素

去細(xì)胞過程涉及化學(xué)、物理和酶處理過程，即使用洗滌劑、鹽、酶及物理手段，去除組織和器官中的細(xì)胞，保留ECM中的部分蛋白質(zhì)，如膠原蛋白，可大大減少免疫排斥性。因此ECM接種患者的種子細(xì)胞，甚至構(gòu)建一個(gè)全新器官，可將排斥的可能性降至最低。目前最簡(jiǎn)單有效的去細(xì)胞方法就是化學(xué)灌注法，即利用洗滌劑或酸，通過破裂細(xì)胞膜和分離細(xì)胞成分去除天然細(xì)胞。常用的化學(xué)試劑如：過乙酸（去胞核效果好，對(duì)ECM結(jié)構(gòu)影響極?。?、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，非離子洗滌劑，在心臟瓣膜去細(xì)胞殘留物最有效）、1%SDS（去除器官中央部分細(xì)胞，較Triton X-100有效）、脫氧膽酸鈉（NaDOC，陰離子去污劑，可完全去除器官的胞質(zhì)蛋白）。研究發(fā)現(xiàn)，分別使用Triton X-100和1%SDS去除豬腎細(xì)胞，前者保留更多的纖維蛋白和生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的存活率、粘附性和增殖效果也更好，目前去細(xì)胞過程中多將二者結(jié)合使用，今后或可設(shè)計(jì)更有效的方法以制備質(zhì)量更好的支架［4］。

為保存結(jié)構(gòu)完整性，盡可能去除殘留DNA，去細(xì)胞過程中使用的方法極為重要?；瘜W(xué)灌注的去細(xì)胞過程受器官大小、重量、厚度、細(xì)胞密度、脂類含量等因素影響，洗滌劑濃度、灌注壓力、時(shí)間、流速有所改變。研究發(fā)現(xiàn)，分別使用0.125、0.25、0.5和1.0%的SDS分別灌注大鼠腎臟4小時(shí)和8小時(shí)，免疫組化檢測(cè)顯示去細(xì)胞效果差異性不顯著，但0.125%的SDS灌注4小時(shí)可保留更多的生長(zhǎng)因子。低濃度SDS恒壓灌注去細(xì)胞前，將器官冷凍或者使用滲透沖擊細(xì)胞膜，去除99%的DNA同時(shí)，能更好的保留ECM微結(jié)構(gòu)，植入的種子細(xì)胞增殖速度更快［10-13］。

1.2 去細(xì)胞支架滅菌和效果評(píng)價(jià)

無論是體外、體內(nèi)研究，ECM支架都要進(jìn)行滅菌，以去除所有內(nèi)毒素及可能的細(xì)菌和病毒DNA。常用的滅菌方法包括射線照射、環(huán)氧乙烷、酸性溶液、抗生素、乙醇或者過氧乙酸處理。酸性溶液處理會(huì)不同程度的破壞ECM微結(jié)構(gòu)，也會(huì)影響再植入種子細(xì)胞的粘附性和增殖率。γ射線照射或環(huán)氧乙烷處理會(huì)改變支架微結(jié)構(gòu)，損失膠原纖維和GAGs，降低種子細(xì)胞增殖率。制備腎支架過程中，常用PBS稀釋抗生素和抗真菌藥物后聯(lián)合灌注滅菌，而近期研究顯示1 M NaCl溶解0.2%過氧乙酸滅菌效果較其它方法更好［4］。

去細(xì)胞過程中纖維蛋白和生長(zhǎng)因子都會(huì)大量減少，更好的保留ECM的微結(jié)構(gòu)、纖維蛋白和生長(zhǎng)因子的去細(xì)胞支架，植入的種子細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖越好。評(píng)價(jià)腎去細(xì)胞后支架ECM的三維結(jié)構(gòu)，目前常用免疫組化法檢查支架ECM中腎小管、腎小球、血管的保留水平，以及去除細(xì)胞的水平（可能導(dǎo)致免疫排斥），用掃描電鏡檢查支架ECM中腎小球基膜的保留水平，使用原子力顯微鏡等方法檢查去細(xì)胞器官的力學(xué)水平，器官去細(xì)胞剛性降低導(dǎo)致坍塌。ECM中生長(zhǎng)因子的保留水平與其生物功能相關(guān)，影響種子細(xì)胞分化成組織特異性細(xì)胞，從而影響器官去細(xì)胞后再生重構(gòu)；生長(zhǎng)因子水平也影響種子細(xì)胞的代謝活性及ECM與細(xì)胞間的互動(dòng)性［14］。去細(xì)胞方法不能100%去除腎臟細(xì)胞的同時(shí)，不損傷ECM結(jié)構(gòu)和蛋白成分，要求每mg干重ECM的DNA殘留量＜50 ng［15］。

1.3 腎臟再生的種子細(xì)胞

腎臟是一種復(fù)雜性器官，包含至少26種細(xì)胞，腎小體就由血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、壁細(xì)胞、球旁細(xì)胞、致密斑、球外系膜細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)成。植入的多種種子細(xì)胞中，干細(xì)胞因其多潛能性脫穎而出，例如不論是從腎動(dòng)脈，還是輸尿管灌注胚胎干細(xì)胞，都會(huì)在腎小管、血管，及腎小球中增殖，并分化成上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，但因倫理問題備受爭(zhēng)議［16］；髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)用于腎臟修復(fù)和再生［17］；由自身體細(xì)胞重排誘導(dǎo)分化得到的多潛能性干細(xì)胞，可分化成胚胎腎臟祖細(xì)胞，并在血管緊張素作用下分化成足細(xì)胞［18］。體外腎臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，包括含有足細(xì)胞的血管化腎小球，以及管腔通暢的近端小管和遠(yuǎn)端小管，因此種子細(xì)胞的重要性不言而喻，干細(xì)胞將在今后的腎臟再生中發(fā)揮重要作用。

2 全腎去細(xì)胞支架再細(xì)胞化

通常使用注射泵或蠕動(dòng)泵，將細(xì)胞懸液勻速的經(jīng)過腎動(dòng)脈或者輸尿管灌注，將全身去細(xì)胞支架植入種子細(xì)胞，或通過注射器將細(xì)胞懸液均勻的注射到全腎去細(xì)胞支架的皮質(zhì)區(qū)域。全腎去細(xì)胞支架再細(xì)胞化的理化性質(zhì)和功能評(píng)價(jià)，包括ECM結(jié)構(gòu)、細(xì)胞粘附性、細(xì)胞增殖分化和遷移情況，以及再生的腎臟功能等，例如使用免疫組化檢測(cè)ECM的立體結(jié)構(gòu)（腎小球的平均直徑、腎小球毛細(xì)血管腔、動(dòng)靜脈的完整性等）與細(xì)胞的粘附及遷移情況；使用免疫染色或者實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞增殖分化情況；使用熒光顯微鏡檢測(cè)電解質(zhì)的重吸收、測(cè)定水解酶活性來監(jiān)測(cè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能、或者利用掃描電鏡、放射性核素等方法檢測(cè)腎功能［4］。

2009年開始，Ross［19-20］團(tuán)隊(duì)開始進(jìn)行全腎去細(xì)胞支架再細(xì)胞化的研究，通過蠕動(dòng)泵灌注法植入種子細(xì)胞后，檢測(cè)到細(xì)胞活力和增殖水平好，并且從入球小動(dòng)脈和腎小球分別遷移到出球小動(dòng)脈和小管周的毛細(xì)血管網(wǎng)。2013年，Ott［21］團(tuán)隊(duì)將腎臟去細(xì)胞基質(zhì)支架體外聯(lián)合內(nèi)皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞培養(yǎng)后，成功將“新生腎臟”移植入大鼠體內(nèi)，初步觀察其具有一定排尿功能。2014年，梅勁［22］團(tuán)隊(duì)將全腎去細(xì)胞支架的下方1/3部分，吻合縫合至活體大鼠切除了約1/3腎下方實(shí)質(zhì)組織的腎處，研究顯示祖細(xì)胞從損傷的腎組織遷徙到移植的支架中，表明支架中ECM良好的理化條件誘導(dǎo)了附近的腎祖細(xì)胞的增殖和分化，出現(xiàn)血管發(fā)生和一定的再生腎功能。但直至目前的全身去細(xì)胞支架再細(xì)胞化，遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床實(shí)際應(yīng)用的要求。

3 展望

通過灌注法獲得含有天然ECM的全腎去細(xì)胞支架，在腎衰竭病患的腎再生和修復(fù)中具有巨大的應(yīng)用前景，在3D打印之外，為腎再生醫(yī)學(xué)的治療提供了一種新的思路。進(jìn)一步完善去細(xì)胞方法以保留ECM更好的理化條件、合適的種子細(xì)胞及全腎去細(xì)胞再細(xì)胞化后種子細(xì)胞的分化及更好的實(shí)現(xiàn)腎功能，都是今后將全腎去細(xì)胞支架再細(xì)胞化后應(yīng)用到臨床移植前期需要解決的關(guān)鍵問題。