異黏蛋白及波形蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系*

付娟娟，徐 茜，楊晨晨,3△

(1.江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院病理科，江蘇無錫 214000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 新疆烏魯木齊 830011；3.無錫太湖學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江蘇無錫 214000)

在全球范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第8位和第6位[1]。由于局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，食管癌的病死率較高，且5年生存率較低，低于20%[2-4]。食道鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)起源于食道上皮細(xì)胞。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，世界上每年超過31萬人死于食管鱗狀細(xì)胞癌。最近的研究發(fā)現(xiàn)食管癌的生物血清標(biāo)記物不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。 因此，篩選更好的腫瘤標(biāo)志物成為一項(xiàng)監(jiān)測發(fā)展的新熱點(diǎn)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)為上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞提供了侵襲轉(zhuǎn)移的條件[5-6]。EMT是上皮細(xì)胞失去極性，失去與基底膜的連接，并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的生物學(xué)過程。EMT的特征通常是抑制細(xì)胞黏附受體E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和細(xì)胞凋亡，促使細(xì)胞遷移和侵襲[7]，其在腫瘤轉(zhuǎn)移和胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，在轉(zhuǎn)移過程中，EMT可破壞細(xì)胞間的緊密連接，并促進(jìn)遷移，獲得自我更新和干細(xì)胞樣特性。異黏蛋白(MTDH)也稱為星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因-1(AEG-1)和富含賴氨酸的CEACAM-1相關(guān)蛋白(Lyric)，最初被鑒定為癌基因，其可通過人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)或用HIV包膜糖蛋白(gp120)或腫瘤壞死因子α(TNF-α)在原始胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)[8-9]。MTDH在致癌作用中起關(guān)鍵作用。MTDH過表達(dá)在多種腫瘤類型中均可見高表達(dá)，例如肝癌、乳腺癌、惡性腫瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，并且與臨床狀況預(yù)后不佳相關(guān)。相關(guān)研究也表明MTDH可通過EMT促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移，在肝癌細(xì)胞中MTDH的抑制導(dǎo)致EMT相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin 和Snail的下調(diào)，以及E-cadherin的上調(diào)。但是在食管癌中MTDH與EMT相關(guān)蛋白的關(guān)系少有報(bào)道。本研究通過探討MTDH及EMT相關(guān)因子波形蛋白(Vimentin)在ESCC組織中的表達(dá)及意義，探討食管癌有關(guān)分子與EMT的關(guān)系，旨在為食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取75對食管鱗狀細(xì)胞癌癌組織及對應(yīng)的配對癌旁正常食管組織(距病灶3 cm以外)，另有30例食管癌組織為不成對的食管癌組織，所有食管癌組織和正常食管組織均來源于組織芯片。所有病例納入符合美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)2009年第7版。

1.2主要試劑 MTDH抗體(稀釋濃度為1∶200，Abcam，美國)、Vimentin抗體(稀釋濃度為1∶200，Abcam，美國)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔源性二抗(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3MTDH、Vimentin檢測方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 光學(xué)顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核和或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色或者黃褐色顆粒染色，即可判斷為MTDH陽性；細(xì)胞核和或細(xì)胞核呈黃棕色染色為Vimentin陽性，每張切片分別隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞比例評分如下：0分(無陽性腫瘤細(xì)胞)，1分(<10%陽性腫瘤細(xì)胞)，2分(陽性腫瘤細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞居于10%～50%)和3分(陽性腫瘤細(xì)胞所占比例>50%)。染色強(qiáng)度根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：0分(無染色)，1分(弱染色=淡黃色)，2分(中度染色=黃棕色)和3分(強(qiáng)染色=棕色)。染色指數(shù)(SI)=染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞比例。高表達(dá)：4≤SI≤9；低表達(dá)：SI≤2。結(jié)果由2位副高以上的病理科醫(yī)生雙盲進(jìn)行診斷。

2 結(jié) 果

2.1MTDH在ESCC及配對癌旁正常食管組織中的表達(dá)及其與ESCC臨床病理的關(guān)系 免疫組織化學(xué)顯示，在食管癌細(xì)胞和少量正常食管上皮細(xì)胞中，可見MTDH的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞主要位于胞質(zhì)，在細(xì)胞核中，也有部分MTDH的陽性表達(dá)，呈淺黃色、棕黃色，部分陽性表達(dá)呈褐色(圖1)。與癌旁正常食管組織比較，MTDH在食管癌組織中的表達(dá)高于配對癌旁正常食管組織。

在86例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，MTDH的陽性表達(dá)率為54.7%(47/86)，在配對癌旁正常食管組織中MTDH的陽性表達(dá)率為14.1%(11/78)，MTDH在食管癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于配對癌旁正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTDH的表達(dá)與其他各臨床病理參數(shù)的關(guān)系顯示，MTDH在食管癌中的表達(dá)與N分期(P=0.016)、分化程度(P=0.005)有關(guān)，見表1。

續(xù)表1 食管癌組織中MTDH的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：A為食管癌組織(×40)；B為食管癌組織(×200)；C為食管癌組織(×400)；D為配對癌旁正常食管組織(×40)；E為配對癌旁正常食管組織(×200)；F為配對癌旁正常食管組織(×400)。

圖1 MTDH在食管癌及配對癌旁正常食管組織中的表達(dá)

2.2MTDH的表達(dá)與食管癌預(yù)后的關(guān)系 高表達(dá)MTDH患者術(shù)后生存時(shí)間較短，低表達(dá)MTDH的患者，術(shù)后生存時(shí)間更長，兩者中位生存時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，患者Kaplan-Meier生存曲線見圖2。

圖2 MTDH高表達(dá)者與MTDH低表達(dá)者Kaplan-Meier生存曲線

注：A為食管癌組織(SP×40);B為食管癌組織(SP×200);C為食管癌組織(SP×400)；D為配對癌旁正常食管組織(SP×40)；E為配對癌旁正常食管組織(SP×200)；F為配對癌旁正常食管組織(SP×400)。

圖3 Vimentin在食管癌及配對癌旁正常食管組織中的表達(dá)

2.3Vimentin在ESCC及配對癌旁正常食管組織中的表達(dá)及其與ESCC臨床病理的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，Vimentin在食管癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，在食管癌細(xì)胞中表達(dá)更多，陽性細(xì)胞主要定位在胞質(zhì)，陽性表達(dá)呈淺黃、棕黃色或褐色顆粒,見圖3。

在105例食管鱗癌組織中，Vimentin的陽性表達(dá)率為51.4%(54/105)，在配對癌旁正常食管組織中Vimentin的陽性表達(dá)率為12.0%(9/105)，Vimentin在食管癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于配對癌旁正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vimentin在T3～T4期、N1～N3期、腫瘤體積>20 cm3的表達(dá)分別高于N0分期及腫瘤體積<20 cm3的食管癌組織，而在不同性別(P=0.480)、不同年齡(P=0.407)、不同病理分級(jí)(P=0.160)、不同大體類型(P=0.242)的食管癌中，Vimentin蛋白的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 食管癌組織中Vimentin的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4Vimentin的表達(dá)與食管癌預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示，Vimentin的高表達(dá)組食管癌患者生存率高于低表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.335)。見圖4。

2.5MTDH與Vimentin表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MTDH與Vimentin在ESCC組織中表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.218，P=0.019)，見表3。

圖4 Vimentin高表達(dá)者與Vimentin低表達(dá)者Kaplan-Meier生存曲線

表3 MTDH與Vimentin在ESCC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析(n)

3 討 論

相關(guān)研究證實(shí)EMT牽涉到多個(gè)生物學(xué)過程，EMT是轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，與上皮腫瘤的惡性行為進(jìn)展有關(guān)，因此已成為癌癥預(yù)防和治療的候選目標(biāo)。EMT在腫瘤中參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤進(jìn)展期，腫瘤細(xì)胞具有EMT的表現(xiàn)：細(xì)胞間黏附力變?nèi)?，E-cadherin的表達(dá)下降，細(xì)胞連接受損，導(dǎo)致上皮極性和細(xì)胞間粘連減少。上皮功能喪失通常伴有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加和表達(dá)間充質(zhì)基因。在侵襲性腫瘤中，EMT是特征性地通過減少上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)和上調(diào)間充質(zhì)基因標(biāo)記(N-鈣黏蛋白)來實(shí)現(xiàn)，在EMT中，上皮細(xì)胞由圓形演變?yōu)榧忓N形細(xì)胞形態(tài)，出現(xiàn)Vimentin的上調(diào)表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的極性繼而會(huì)消失，促使細(xì)胞黏附能力下降，繼而增加了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，這有助于更多的基質(zhì)細(xì)胞黏附特征并增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)EMT是細(xì)胞獲得逃逸能力的過程，是從上皮層侵入間質(zhì)并形成轉(zhuǎn)移灶的過程，與多種腫瘤，如卵巢癌的預(yù)后密切相關(guān)。

食管癌發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移與EMT相關(guān)，EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中最關(guān)鍵的步驟[11]，一般來說，鈣黏蛋白表達(dá)的缺失或減少及間質(zhì)標(biāo)志物的誘導(dǎo)上調(diào)是EMT發(fā)生的主要標(biāo)志。在EMT過程中，除了上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)的變化，還常常伴隨有間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)的改變。Vimentin即波形蛋白，屬中間絲蛋白，主要表達(dá)于間葉組織細(xì)胞中，而在上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。Vimentin可通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。大量研究結(jié)果證實(shí)，在多種惡性上皮性腫瘤組織中，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，而Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，且E-cadherin低表達(dá)和Vimentin高表達(dá)與腫瘤EMT及侵襲轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。因此，本研究采用免疫組化染色分析中EMT相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá)量的變化。DUARTE等[12]研究發(fā)現(xiàn)波形蛋白在細(xì)胞分裂過程中表現(xiàn)出明顯的可塑性，支持細(xì)胞的基本功能和重組。波形蛋白絲在有絲分裂過程中重新分布到細(xì)胞皮層，形成一個(gè)與皮層肌動(dòng)蛋白交織在一起并影響其組織的堅(jiān)固的骨架，促進(jìn)有絲分裂進(jìn)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vimentin在食管癌組織中的表達(dá)主要為強(qiáng)陽性或中度陽性，在癌旁正常食管組織中的表達(dá)為陰性或弱陽性，在食管癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Vimentin的升高在很多腫瘤中都被視為發(fā)生EMT的轉(zhuǎn)化，本研究與其結(jié)果相似，在食管癌組織中的表達(dá)升高，提示EMT轉(zhuǎn)化與腫瘤發(fā)生相關(guān)。有研究報(bào)道，食管鱗癌組織中E-cadherin表達(dá)降低，Vimentin表達(dá)升高，說明EMT的發(fā)生與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究與其相似。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌中Vimentin表達(dá)升高，Vimentin在食管癌中的表達(dá)與T分期(P=0.016)、N分期(P=0.018)、腫瘤體積(P=0.040)有關(guān)，證實(shí)食管鱗癌中確實(shí)存在EMT的現(xiàn)象，EMT在腫瘤的發(fā)現(xiàn)中起到了促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。

MTDH是一種與惡性細(xì)胞高度相關(guān)的新型致癌基因，參與增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成等生物學(xué)過程[13-14]。MTDH參與多種癌癥相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，MTDH能促血管生成和促轉(zhuǎn)移途徑。MTDH促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制凋亡，并通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。進(jìn)一步研究報(bào)道，MTDH也與EMT相關(guān)，在肝細(xì)胞癌中，MTDH和E-cadherin、β-catenin、Snail和N-cadherin的表達(dá)有關(guān)。 MTDH在致癌作用中起關(guān)鍵作用，包括腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性。MTDH促進(jìn)能通過PI3K/Akt的磷酸化而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；此外，MTDH增強(qiáng)血管生成因子的表達(dá)，例如缺氧誘導(dǎo)因子1-α和基質(zhì)金屬蛋白酶9，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。異常表達(dá)和MTDH的功能障礙參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌和前列腺癌等。ZHANG等[15]研究表明MTDH在結(jié)腸癌的組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且MTDH的表達(dá)與年齡、腫瘤部位、TNM分期及組織學(xué)分化程度有關(guān)，高M(jìn)TDH表達(dá)者的生存率要明顯低于低表達(dá)者，COX回歸分析顯示MTDH表達(dá)水平是影響大腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。DHIMAN等[16]研究提出MTDH可能是多個(gè)腫瘤的治療靶點(diǎn)，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和食道癌。MTDH的高表達(dá)與前列腺癌有關(guān)，另外，MTDH在功能上與Ha-Ras癌基因相互作用并導(dǎo)致黑素細(xì)胞的進(jìn)展。MTDH的表達(dá)還與乳腺癌干細(xì)胞的生長及對紫杉醇和曲妥珠單抗的耐受有關(guān)。同時(shí)，MTDH在唾液腺腫瘤中的表達(dá)升高，并與患者的預(yù)后有關(guān)。MTDH的表達(dá)增加也與肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在結(jié)腸癌中MTDH可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶9，發(fā)揮促癌作用。MTDH的增加也與AKT/PI3K介導(dǎo)的頭頸部鱗狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。相關(guān)研究報(bào)道顯示，胃癌和非小細(xì)胞肺癌中，MTDH可通過肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重塑調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究報(bào)道MTDH與鱗狀細(xì)胞癌的高表達(dá)有關(guān)[17-18]，MTDH在食管癌中的表達(dá)與N分期(P=0.016)相關(guān)；發(fā)生淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)TDH表達(dá)的陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合Kaplan-Meier生存曲線，患者M(jìn)TDH的表達(dá)越高，術(shù)后中位生存時(shí)間越短，低MTDH表達(dá)的患者生存時(shí)間更長(P=0.001)，說明MTDH蛋白表達(dá)程度與食管癌的惡性程度有一定的關(guān)系，且與預(yù)后密切相關(guān)，因此，推測可以通過檢測食管癌組織中MTDH的蛋白表達(dá)水平來判斷食管癌進(jìn)程，并對食管癌的預(yù)后幫助有一定的幫助。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)MTDH與Vimentin在食管癌組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.218，P=0.019)，提示MTDH和Vimentin在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中二者相互影響，可能具有促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

食管癌組織癌細(xì)胞中存在EMT現(xiàn)象，參與食管癌的浸潤及轉(zhuǎn)移，MTDH在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中表達(dá)水平顯著上升，且與發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能具有促進(jìn)食管癌發(fā)生及腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制可能與MTDH與Vimectin相互促進(jìn)彼此的表達(dá)相關(guān)。本研究為闡明食管癌的發(fā)病機(jī)制提供了資料，也為食管癌的臨床診斷治療和預(yù)后分析提供了理論依據(jù)。聯(lián)合檢測MTDH和Vimectin的表達(dá)可作為更為理想的腫瘤標(biāo)記物輔助食管癌的診斷。