子宮內(nèi)膜癌患者血清及癌組織中microRNA-195的表達(dá)水平及意義*

岳奇芳,陳 然,李 園,張雪琪,趙小萌△

(1.石家莊心腦血管病醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050000； 2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，河北石家莊 050000)

隨著社會(huì)人口老齡化的進(jìn)展、環(huán)境污染、生活方式改變及病毒感染，國內(nèi)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率及檢出率逐年上升，并呈年輕化趨勢(shì)。盡管近年來子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療水平有了很大程度的提高，但其仍然是導(dǎo)致女性癌性相關(guān)死亡的首要原因[1]。microRNAs也稱微小RNA，是一小組內(nèi)源性非編碼RNA基因，能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在多種真核生物的病理生理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[2]。目前臨床學(xué)者對(duì)腫瘤的研究越來越集中在microRNAs分子上，其中microRNA-195已被證實(shí)與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]，但關(guān)于microRNA-195在子宮內(nèi)膜癌中的研究甚少，若能明確二者的關(guān)系，將有望為子宮內(nèi)膜癌的分子機(jī)制及治療方向研究提供依據(jù)。為此，本研究主要觀察microRNA-195在子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 子宮內(nèi)膜癌癌組織及對(duì)應(yīng)腫瘤邊緣2～5 cm處的癌旁組織來源于2018年1—4月石家莊心腦血管病醫(yī)院接受子宮內(nèi)膜癌分期手術(shù)治療的60例患者(病例組)，術(shù)后病理組織學(xué)檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌，已排除未取得癌旁組織、未接受過放化療或激素治療、臨床資料欠完善的患者。年齡29～55歲，平均(45.45±6.29)歲；病理類型：子宮內(nèi)膜樣腺癌55例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌5例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)手術(shù)病理分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期27例，Ⅲ期15例；病理分級(jí)：G1級(jí)20例，G2級(jí)29例，G3級(jí)11例；肌層浸潤深度：<1/2肌層35例，≥1/2肌層25例；雌激素受體(ER)陽性35例，孕激素受體(PR)陽性39例、原癌基因人類表皮生長因子受體2(Her-2)陽性43例。同時(shí)抽取同期入院行婦科體檢的30例健康者作為對(duì)照(健康組)，年齡27～50歲，平均(44.77±8.07)歲。本研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2儀器與試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；DMEM 培養(yǎng)基(Corning公司)；胎牛血清(FCS)由美國HyClone公司提供；Cycleave?反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；梯度PCR儀(美國Bio-rad公司)；定量PCR儀(美國ABI公司)；紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；microRNA-195及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)microRNA-195表達(dá) 清晨空腹時(shí)抽取各實(shí)驗(yàn)對(duì)象外周靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑(上海新睿)，2 h內(nèi)于4 ℃、10 000×g離心10 min，離心后提取上層血清備用。同時(shí)挑取病例組患者子宮內(nèi)膜癌、癌旁組織進(jìn)行研磨，加入細(xì)胞裂解液處理，并遵照TRIzol試劑說明書提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量。microRNA-195上游引物為 5′-CGT AGC AGC ACA GAA AT-3′，下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG GGT-3；對(duì)照內(nèi)參U6上游引物為5′-GTG CTC CCT GCT TCG GCA GCA CAT ATA C-3′，下游引物為5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG-3′。qPCR總反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green PCR Master混合物10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s；55 ℃ 30 s；72 ℃延伸30 s，75 ℃熒光收集30 s，36個(gè)循環(huán)。所有步驟均帶有陽性、陰性質(zhì)控。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，留取Ct值，結(jié)果取平均值，分別計(jì)算引物與內(nèi)參的ΔCt值[ΔCT=Ct(microRNA-195)-Ct(U6)]。以2-ΔΔCt得出血清及組織子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中microRNA-195相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1病例組、健康組血清microRNA-195表達(dá)水平比較 與健康組[(1.32±0.40)]相比，病例組血清microRNA-195表達(dá)水平[(0.51±0.17)]明顯低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.599，P<0.05)。

2.2血清microRNA-195診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線分析 血清microRNA-195對(duì)診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線，顯示曲線下面積為0.778(95%CI：0.692～0.864)，根據(jù)最大約登指數(shù)確定血清最佳閾值為0.742，此時(shí)血清microRNA-195診斷子宮內(nèi)膜癌的靈敏度、特異度分別為76.67%(46/60)、73.33%(22/30)。見圖1。

圖1 血清microRNA-195對(duì)診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線

2.3子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織microRNA-195表達(dá)水平 與癌旁組織相比[(1.18±0.23)]，子宮內(nèi)膜癌癌組織中microRNA-195相對(duì)表達(dá)量明顯低[(0.45±0.19)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.954，P<0.05)。

2.4microRNA-195表達(dá)水平與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 不同的年齡、病理類型、病理分級(jí)、ER、PR表達(dá)強(qiáng)度的子宮內(nèi)膜癌癌組織microRNA-195表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而microRNA-195表達(dá)水平Ⅰ期癌組織>Ⅱ期癌組織>Ⅲ期癌組織，浸潤深度≥1/2肌層的癌組織microRNA-195表達(dá)水平明顯高于浸潤深度<1/2肌層的癌組織，Her-2陰性的癌組織癌組織microRNA-195表達(dá)水平明顯高于Her-2陽性的癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 microRNA-195表達(dá)水平與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

本研究于2018年上半年取得子宮內(nèi)膜癌癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本60例，并嘗試從microRNAs的角度分析子宮內(nèi)膜癌的病理特征，microRNAs是一類新能夠調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA(全長為19～25 nt)，能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在多種真核生物的病理生理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，主要通過與靶microRNAs的3′非編碼區(qū)配對(duì)結(jié)合發(fā)揮作用，繼而導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄阻遏或降解。近年來，臨床報(bào)道一致認(rèn)為，microRNAs不但可扮演抑癌基因的角色下調(diào)原癌基因活性，而且可轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗蛳抡{(diào)抑癌基因活性[5-6]。因此，臨床學(xué)者對(duì)腫瘤的研究越來越集中在microRNAs分子上，周胤健等[7]指出，采用qPCR可準(zhǔn)確獲取microRNAs的表達(dá)量，篩選獲得子宮內(nèi)膜癌microRNAs的差異表達(dá)譜，如microRNA-205，microRNA-200b、microRNA-216b、microRNA-15b等，均可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，并影響預(yù)后。而microRNA-195是microRNA-15/16/195/424/497家族的重要角色，最初被發(fā)現(xiàn)于老鼠基因，而后經(jīng)過同源序列預(yù)測(cè)，證實(shí)在人類基因也存在，位于人類染色體17p13.1上。作為抑癌分子，microRNA-195可靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路或生物學(xué)相關(guān)蛋白，繼而干擾細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)生物學(xué)效應(yīng)過程。目前，microRNA-195已被證實(shí)在胃癌[8]、胰腺癌[9]、直腸癌[10]、肝癌[11]等惡性腫瘤中可發(fā)揮抑癌基因作用。婦科腫瘤中，趙靜[12]、SONG等[13]研究采用qPCR檢測(cè)microRNA-195在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)；且上調(diào)microRNA-195能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示microRNA-195是宮頸癌潛在的治療生物標(biāo)志物。但在子宮內(nèi)膜癌癌組織中的表達(dá)情況鮮見報(bào)道。

本研究采用qPCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者血清及癌組織、對(duì)應(yīng)癌旁組織microRNA-195的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與健康組相比，病例組血清microRNA-195表達(dá)水平明顯低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清microRNA-195診斷子宮內(nèi)膜癌的靈敏度、特異度均高于70%。由于外周血樣本易獲得，且血循環(huán)microRNAs不易被RNA酶降解，故認(rèn)為血清microRNAs表達(dá)可輔助診斷和鑒別診斷子宮內(nèi)膜癌，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，與癌旁組織相比，子宮內(nèi)膜癌癌組織中microRNA-195相對(duì)表達(dá)量明顯低，且子宮內(nèi)膜癌癌組織中microRNA-195低表達(dá)與對(duì)應(yīng)患者年齡、病理類型、病理分級(jí)、ER和PR表達(dá)強(qiáng)度無關(guān)，而microRNA-195表達(dá)水平Ⅰ期癌組織>Ⅱ期癌組織>Ⅲ期癌組織，浸潤深度≥1/2肌層的癌組織microRNA-195表達(dá)水平明顯高于浸潤深度<1/2肌層的癌組織，Her-2陰性的癌組織癌組織microRNA-195表達(dá)水平明顯高于Her-2陽性的癌組織，提示子宮內(nèi)膜癌癌組織中microRNA-195低表達(dá)與臨床分期、浸潤深度及Her-2表達(dá)強(qiáng)度密切相關(guān)。其中，Her-2原癌基因借助點(diǎn)突變、過量表達(dá)與擴(kuò)增后可逐漸被活化，可通過多種信號(hào)途徑影響腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲，并可降低宿主防御腫瘤的能力，已被證實(shí)與子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展密切相關(guān)[14]。因此，認(rèn)為microRNA-195在子宮內(nèi)膜癌癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)可能對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有一定促進(jìn)作用，推測(cè)與microRNA-195低表達(dá)對(duì)宮頸癌進(jìn)展的機(jī)制類似，即低水平microRNA-195表達(dá)不利于抑制細(xì)胞增殖，而上調(diào)表達(dá)后細(xì)胞增殖能力明顯減弱，阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能為microRNA-195影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，且是否影響患者預(yù)后仍需隨訪后補(bǔ)充論證。此外，microRNA-195通常分為microRNA-195-3p和microRNA-195-5p，本研究受檢測(cè)條件的限制，具體何種指標(biāo)對(duì)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用尚未進(jìn)行論證，將有待于后期深入分析。

4 結(jié) 論

microRNA-195在子宮內(nèi)膜癌癌組織中呈低表達(dá)，且與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能為其機(jī)制之一，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，且是否影響患者預(yù)后仍需隨訪后補(bǔ)充論證。