符 亮,袁永強,李 玲,王 科
(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗科,重慶 402160)
無論是在中國還是歐美等發(fā)達國家,乳腺癌都是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)全球癌癥年報數(shù)據(jù)顯示,2012 年全球共有170 萬新發(fā)乳腺癌病例,2018年增加到了210萬例,乳腺癌死亡病例數(shù)由2012年的52萬增加到2018年的63萬,乳腺癌的發(fā)病率和病死率都躍居女性惡性腫瘤中的首位[1-2]。雖然近年來以手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療等綜合治療方法使乳腺癌的治療取得了滿意成效,但其病死率仍然居高不下,據(jù)統(tǒng)計,乳腺癌病死率比上世紀末增長了38.4%,乳腺癌已嚴重威脅女性健康,防治形勢嚴峻[3]?,F(xiàn)階段乳腺癌患者療效及預(yù)后情況仍不樂觀。主要原因是缺乏早期診斷、治療敏感和預(yù)后判斷的特異性的分子生物標志物。隨著精確醫(yī)學(xué)時代來臨,在分子層面有關(guān)乳腺癌早期診斷、治療及與預(yù)后觀察的分子標志物的研究日益增多,深入研究乳腺癌的分子病理生理機制,尋找一些新型分子標志物預(yù)測乳腺癌的發(fā)展和預(yù)后,指導(dǎo)個體化治療,以期改善患者的預(yù)后,提高乳腺癌患者生存質(zhì)量,引起研究者們極大的關(guān)注。
目前研究表明,線粒體核糖體蛋白(MRP)基因的表達差異和MRP基因改變介導(dǎo)的線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。MRPL13由核基因編碼,位于8號染色體q24.12上,是MRP的主要組成部分,主要協(xié)助線粒體蛋白的生物合成。雖然已有多項關(guān)于MRP基因在不同類型腫瘤表達差異的研究,但目前關(guān)于MRPL13表達在乳腺癌中的相關(guān)作用尚未見報道。本研究通過利用Oncomine、cBioPortal和String等多個數(shù)據(jù)庫探索MRPL13在乳腺癌組織中表達情況和生物學(xué)功能,預(yù)測其在乳腺癌中預(yù)后的價值,為乳腺癌預(yù)后判斷及相關(guān)分子機制提供有力的數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫 為獲取MRPL13在乳腺正常組織及癌組織的表達差異,在Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html/)設(shè)置搜索條件:(1)“Gene:MRPL13”;(2)“Analysis Type:Cancer vs.Normal Analysis”;(3)“Cancer Type:Breast Cancer”;(4)“Date Type:mRNA”;(5)“Sample Type:Clinical Specimen”,并進一步設(shè)置P=0.05,差異倍數(shù):1.5,gene bank為前10%獲取相關(guān)資料。
1.2cBioPortal數(shù)據(jù)庫 利用癌癥基因圖譜(TCGA)的子數(shù)據(jù)庫可視化在線數(shù)據(jù)庫cBioPortal(http://www.cBioPortal.org/index.do)獲取臨床數(shù)據(jù),搜索條件為“Breast Invasive Carcinoma(TCGA,Cell 2015)”子庫數(shù)據(jù),選定“Putative copy-number alterations from GISTIC、mRNA Expression,Select one of the profiles below:mRNA Expression z-scores(RNA Seq V2 RSEM)”,進一步通過“OncoPrint”、“Co-expression”和“Survival”分別獲得“MRPL13”在乳腺癌組織中的表達情況和共表達相關(guān)基因,以及分析乳腺癌患者生存預(yù)后臨床信息。
1.3癌癥細胞系百科全書(CCLE) 通過利用CCLE(http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome/resource/Cancer+Cell+Line+Encyclopedia)對MRPL13 基因進行組織細胞系分析,從而得到MRPL13基因在細胞系中的表達情況。
1.4String數(shù)據(jù)庫與DAVID數(shù)據(jù)庫 通過String數(shù)據(jù)庫(www.string.org)獲取這些共表達基因的互作用關(guān)系組并進一步確定共表達網(wǎng)絡(luò)。接著利用DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對MRPL13進行生物學(xué)和信號通路功能分析,功能富集采用基因本體論(GO)分析,信號通路采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫分析。
1.5The human protein atlas數(shù)據(jù)庫 在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org/)內(nèi)輸入關(guān)鍵字 “MRPL13”,選擇 “Pathology”模塊,找到MRPL13抗體(No:HPA060899)在乳腺癌中的蛋白免疫組化實驗展開分析。
1.6Kaplan-Meier Plotter在線分析工具 利用Kaplan-Meier Plotter在線分析工具[5](http://www.kmplot.com/)對乳腺癌患者總生存率進行分析,設(shè)置條件:(1)“Cancer type:breast cancer”;(2)“Gene:MRPL13”;(3)“Survival:OS”。
1.7統(tǒng)計學(xué)處理 在共表達基因相關(guān)性分析中,對Spearman相關(guān)系數(shù)>0.55的基因進一步篩選。關(guān)于功能及通路富集分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。生存分析采用Kaplan-Meier法,計數(shù)資料用n/%表示,用χ2檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1乳腺癌中MRPL13的表達情況 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫,獲得了7項研究涉及MRPL13在乳腺癌組織和正常組織中的表達情況,共2 999個樣本,其中包括不同臨床類型的乳腺癌(乳腺小葉癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、乳腺導(dǎo)管原位癌、乳腺小管癌等),結(jié)果顯示相較于正常乳腺組織,MRPL13表達水平在不同類型的乳腺癌中均顯著增高(P<0.05),見表1、圖1。為了進一步證實MRPL13在乳腺癌組織表達上調(diào),進一步從cBioPortal可視化在線數(shù)據(jù)庫中獲取了816例臨床樣本,在這些臨床中43%的樣本(348例)MRPL13基因表達上調(diào)或擴增。同時,繼續(xù)從CCLE數(shù)據(jù)庫里獲取了37類人體腫瘤的相關(guān)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示癌組織中MRPL13基因細胞系均具有不同程度的表達,其中乳腺癌排在第2位,顯示在乳腺癌腫瘤組織中MRPL13基因高表達(圖2)。因此從3個不同數(shù)據(jù)庫(Oncomine 數(shù)據(jù)庫、cBioPortal數(shù)據(jù)庫和CCLE數(shù)據(jù)庫)中獲得了一致結(jié)果,MRPL13蛋白在乳腺癌組織表達上調(diào)。
表1 不同類型的乳腺癌組織與正常組織MRPL13表達差異
注:A來源于ZHAO乳腺癌數(shù)據(jù)集(Zhao breast statistics),是正常乳腺組織和乳腺小葉癌組織的MRPL13的表達水平的比較;B來源于ZHAO乳腺癌數(shù)據(jù)集(Zhao breast statistics),是正常乳腺組織和導(dǎo)管型乳腺癌組織的MRPL13的表達水平的比較;C來源于RICHARDSON 乳腺癌數(shù)據(jù)集(Richardson breast statistics),是正常乳腺組織和導(dǎo)管型乳腺癌組織的MRPL13的表達水平的比較。
圖1 MRPL13在正常乳腺組織與癌組織中的表達差異
圖2 MRPL13在細胞系中的分析
2.2MRPL13共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能分析 為了進一步探索MRPL13及其共表達基因在乳腺癌中可能發(fā)揮的作用機制,為科研及臨床治療提供線索,利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫前期篩選到與MRPL13共表達的基因,并選擇中等程度以上共表達的基因,并進一步通過String數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)它們的共表達基因的互作關(guān)系組,節(jié)點共有71個,即共有71種蛋白質(zhì)與MRPL13蛋白有著直接或間接的聯(lián)系,蛋白網(wǎng)絡(luò)圖富集P為9.1×10-10,見圖3。
通過利用DAVID數(shù)據(jù)庫進一步探索MRPL13在乳腺癌中的生物學(xué)功能,生物學(xué)過程主要富集在細胞有絲分裂周期和減數(shù)分裂的調(diào)節(jié),DNA代謝及重組修復(fù)、RNA加工修飾、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、雙鏈斷裂修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)錄起始點的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后的修飾與加工及蛋白質(zhì)大分子復(fù)合體的組裝;分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始點結(jié)合的調(diào)控;這些功能的發(fā)揮主要依賴于核膜、核內(nèi)腔、線粒體膜、核質(zhì)、染色體、細胞器內(nèi)膜、核糖體、核仁、氧化呼吸鏈及周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等。KEGG通路分析主要富集在細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂等,見表2。
圖3 MRPL13基因共表達網(wǎng)絡(luò)圖
表2 與MRPL13密切相關(guān)的基因及基因功能富集分析
注:BP為生物學(xué)過程;CC為細胞組分;MF為分子功能;KEGG為京都基因與基因組百科全書。
2.3MRPL13在乳腺癌中的蛋白表達情況 從The human protein atlas數(shù)據(jù)庫中獲取到12例乳腺癌組織的蛋白表達情況,共12例,包括9例乳腺導(dǎo)管癌和3例乳腺小葉癌,發(fā)現(xiàn)MRPL13在乳腺癌組織中呈現(xiàn)中等程度的陽性蛋白表達有10例(圖4A),僅有2例呈現(xiàn)弱陽性蛋白表達(圖4B),幾乎全部集中表達在細胞質(zhì)與細胞膜內(nèi)。
注:A為乳腺癌組織中中等程度陽性的MPRL13蛋白的表達;B為乳腺癌組織中弱陽性MPRL13蛋白的表達。A和B均采用免疫組化染色,放大倍數(shù)×200。
圖4 MRPL13在乳腺癌中蛋白表達情況
注:A是基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫的生存率圖,1表示MRPL13低表達病例,2表示MRPL13高表達病例;B是基于網(wǎng)絡(luò)在線工具Kaplan-Meier Plotter的生存率圖,3表示MRPL13低表達病例,4表示MRPL13高表達病例。
圖5 MRPL13表達量與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系
2.4MRPL13高表達與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系 基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)在814例乳腺癌患者中,低表達組的乳腺癌患者(348例)的平均生存期是140.18個月,而高表達組(466例)的平均生存期則是113.7個月,MRPL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001 01),見圖5A。利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Kaplan-Meier Plotter分析1 402例乳腺癌患者與MRPL13表達總生存率的關(guān)系,結(jié)果也顯示MRPL13基因高表達與乳腺癌患者總生存率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011),見圖5B。綜上,兩個數(shù)據(jù)庫均發(fā)現(xiàn)MRPL13表達水平對乳腺癌患者的總生存時間有著顯著影響,提示MRPL13高表達患者預(yù)后較差。
近年來,乳腺癌患者的生存質(zhì)量得到了很大程度的改善,但是發(fā)病率逐年升高,且仍有部分患者預(yù)后較差,因此深入研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找新的治療靶點和預(yù)后標志物十分重要[6]。最近一項針對人類9種不同腫瘤的基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)MRP基因在癌癥組織中的表達存在顯著差異[7]。然而,目前仍然不清楚OXPHOS缺陷在腫瘤中的發(fā)生發(fā)展作用機制。但是已有多項研究發(fā)現(xiàn)MRP基因表達差異和改變與OXPHOS損傷密切相關(guān)。例如,有研究發(fā)現(xiàn)MRPL11表達下調(diào)是OXPHOS表達改變和翻譯缺陷的決定因素,并且在人體頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[8]。同時也有研究表明結(jié)直腸癌發(fā)生和進展中存在多個MRP基因的表達上調(diào),其中MRPL21和MRPL16呈明顯高表達,這些上調(diào)表達的MRP基因可作為結(jié)直腸癌潛在的預(yù)后標志物[9]。在一項裸鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),MRPL28基因的表達差異直接影響線粒體代謝過程的改變,并且這種改變是胰腺癌侵襲進展的關(guān)鍵[10]。然而,將MRP改變與癌細胞活性聯(lián)系起來的潛在機制仍有待闡明。
目前有研究發(fā)現(xiàn),線粒體缺陷參與腫瘤細胞的生長及侵襲,并且腫瘤OXPHOS缺陷主要與人類線粒體DNA(mtDNA)缺失或點突變有關(guān)。mtDNA是一個雙鏈環(huán)狀DNA,可編碼13種蛋白,并且這13種蛋白都是OXPHOS系統(tǒng)中有氧呼吸產(chǎn)生ATP的重要成分,而13種必需OXPHOS蛋白亞基的生物合成mtDNA編碼合成的最終執(zhí)行者依賴線粒體核糖體[11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn),由MRPL13介導(dǎo)的 OXPHOS缺陷可以通過增強CLN1表達來進一步增加肝癌細胞侵襲活性,導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良[12]。但目前MRPL13在乳腺癌中的作用仍不清楚。腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展高度依賴OXPHOS,其在迅速形成結(jié)節(jié)腫塊過程中會經(jīng)歷間歇性缺氧,因此以往人們認為OXPHOS缺陷是一種癌癥伴隨現(xiàn)象,然而近些年來多項研究支持OXPHOS損害與腫瘤侵襲密切相關(guān)[13-15]。線粒體內(nèi)含13個編碼線粒體OXPHOS的蛋白質(zhì),但只產(chǎn)生13個mtDNA編碼的OXPHOS亞基,而線粒體核糖體才是合成必需OXPHOS蛋白的最終執(zhí)行者[11,16]。人類MRP包括小的28S和大的39S亞基。小亞單位(MRPS)由30個有絲分裂核糖體蛋白組成,大亞單位(MRPL)由52個MRPS組成[17]。有研究表示線粒體功能障礙促進遷移和侵襲性腫瘤細胞活動,在許多癌癥中通過活性氧生成或低氧誘導(dǎo)因子1α積累[18]。這些結(jié)果均表明,深入研究MRP與腫瘤進展之間關(guān)系,可能有助于理解腫瘤發(fā)生過程中涉及的新的分子和代謝機制。
在本研究中,首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析獲取了MRPL13在不同類型乳腺癌中均呈現(xiàn)表達顯著上調(diào)的情況,然后再通過TCGA的可視化在線數(shù)據(jù)庫cBioPortal和CCLE數(shù)據(jù)庫獲得一致結(jié)果,緊接著從The human protein atlas數(shù)據(jù)庫中獲取到MRPL13在乳腺癌組織中呈現(xiàn)中等程度的陽性蛋白表達。因此,從多種不同得數(shù)據(jù)庫,不同的角度證實了MRPL13在乳腺癌組織表達上調(diào)。在此理論基礎(chǔ)上,利用String數(shù)據(jù)庫與DAVID數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了MRPL13表達網(wǎng)絡(luò)和GO分析及KEGG分析,通過對MRPL13共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析發(fā)現(xiàn)其可能參與細胞有絲分裂周期和減數(shù)分裂的調(diào)節(jié),DNA代謝及重組修復(fù)、RNA加工修飾、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、雙鏈斷裂修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)錄起始點的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后的修飾與加工及蛋白質(zhì)大分子復(fù)合體的組裝;并且對轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始點結(jié)合進行調(diào)控;這些功能的發(fā)揮依賴于核膜、核內(nèi)腔、線粒體膜、核質(zhì)、染色體、細胞器內(nèi)膜、核糖體、核仁、氧化呼吸鏈及周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等,同時也參與細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂所涉及的信號通路。最后,通過cBioProtal數(shù)據(jù)庫進行生存分析發(fā)現(xiàn)MPRL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短,提示乳腺癌患者預(yù)后不良;同時又利用了網(wǎng)絡(luò)在線工具Kaplan-Meier Plotter進行分析,得到結(jié)論相一致。但仍需實驗對MRPL13在乳腺癌中的表達及功能進行驗證,深入探討其功能和作用機制。
通過使用Oncomine數(shù)據(jù)庫、cBioPortal、CCLE數(shù)據(jù)庫和The human protein atlas數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果MRP L13在乳腺癌癥組織中表達上調(diào),并進一步通過蛋白水平發(fā)現(xiàn)MRPL13蛋白呈現(xiàn)中等程度表達且主要集中表達在細胞質(zhì)與細胞膜內(nèi)。最后利用cBioProtal數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)在線工具Kaplan-Meier Plotter分析對MRPL13高表達組乳腺癌患者進行生存分析發(fā)現(xiàn)MPRL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短,提示乳腺癌患者預(yù)后不良。MRP L13可以作為乳腺癌的一種潛在的新型分子診斷和預(yù)后評估生物標志物,該研究為科研實驗和臨床研究提供了線索,需實驗對MRPL13在乳腺癌中的表達及功能進行驗證,深入探討其功能和作用機制。