MicroRNA-199a-5p和HIF-1α在慢性阻塞性肺疾病上皮細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性*

李 新,努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪,穆清爽,古力鮮·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，新疆烏魯木齊830063)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是影響中老年群體重要的呼吸系統(tǒng)疾病，以反復(fù)發(fā)作肺部感染、呼吸受限為主要臨床表現(xiàn)，可進(jìn)展至呼吸衰竭，甚至猝死。據(jù)數(shù)據(jù)顯示[1]，COPD已成為我國疾病主要死亡原因第四位，隨著環(huán)境污染和人口老齡化加劇，患病率和病死率還在不斷上升，嚴(yán)重威脅國民生活質(zhì)量。研究一致認(rèn)為COPD的發(fā)生與環(huán)境、氣道高反應(yīng)和慢性炎癥密切相關(guān)[2]，吸煙、粉塵顆粒和氣道微生物常常作為COPD的始動和加重因素，誘導(dǎo)機體氣道高反應(yīng)性和慢性炎性反應(yīng)[3]，多種細(xì)胞成分如肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集，進(jìn)而釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α[4]、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、MicroRNA-199a-5p[5]等，最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生和發(fā)展。

上皮細(xì)胞是氣道的原始細(xì)胞，在維持氣道濕度、通透性、氣流進(jìn)入、黏液排出、肺泡功能等方面發(fā)揮重要作用。COPD患者經(jīng)肺泡灌洗可發(fā)現(xiàn)[6]，上皮細(xì)胞脫落增多，伴大量黏液和炎癥因子分泌。研究證實[7-8]，HIF-1α在機體慢性缺氧、氣道重塑方面扮演重要角色，早期可維持機體適應(yīng)缺氧環(huán)境，但長期持續(xù)缺氧又可顯著上調(diào)其表達(dá)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞功能障礙，引起氣道組織重塑，加重肺功能。同時，HIF-1α可通過多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加炎癥介質(zhì)的釋放，共同影響氣道組織結(jié)構(gòu)。此外，MicroRNA-199a-5p屬于小分子非轉(zhuǎn)錄mRNA，主要功能是沉默靶基因功能，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)缺失，引起對應(yīng)功能異常。部分研究指出[9-10]，MicroRNA-199a-5p在COPD、肺部感染及呼吸衰竭等疾病中表達(dá)上調(diào)，可能參與疾病的發(fā)生和預(yù)后。目前，經(jīng)纖維支氣管鏡下肺泡灌洗技術(shù)不斷成熟，適應(yīng)范圍不斷擴大，在COPD的治療中有確切療效和較好的安全性[11]。因此，該研究通過對COPD患者肺泡灌洗獲得上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)，探討與疾病分期和嚴(yán)重程度的相關(guān)性以及兩者間的表達(dá)關(guān)系，為疾病的發(fā)生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2019年5月本院診斷COPD患者共120例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)符合COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；(3)有肺泡灌洗指征；(4)取得知情同意，臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病情嚴(yán)重，伴意識障礙，呼吸衰竭；(2)合并肺癌、支氣管擴張；(3)嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙。根據(jù)疾病發(fā)生狀態(tài)分為穩(wěn)定期80例，急性發(fā)作期40例，根據(jù)肺功能檢測分為輕度30例，中度60例，重度30例；患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1、2。

表1 不同疾病發(fā)生狀態(tài)的患者基線資料比較

表2 不同肺功能的患者基線資料比較

1.2儀器與試劑 紫外分光光度計(美國賽默飛世爾公司)、熒光定量PCR 儀(美國ABI公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)。TRIzol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)、Master Mix(美國Sigma公司)。

1.3肺泡灌洗及觀察指標(biāo) 經(jīng)肺泡灌洗獲得上皮細(xì)胞，并鑒定細(xì)胞形態(tài)，然后采用實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平，分析不同疾病分期和嚴(yán)重程度患者間MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)的差異性，以及兩者間的相關(guān)性。肺泡灌洗主要流程：入院完善相關(guān)檢查，綜合評估病情和操作安全性，準(zhǔn)備搶救藥品。術(shù)前禁食水，常規(guī)開放靜脈通道，0.5%地卡因氣道噴霧局部麻醉，評估麻醉深入，滿意后取仰臥位，經(jīng)鼻孔緩慢插入纖維支氣管鏡，確定前端位置，根據(jù)術(shù)前X線或CT成像特征，確定灌洗部位，全面了解氣道解剖、支氣管黏膜病變；灌洗時先采用2%利多卡因局部麻醉，分次、臨近多點灌洗，經(jīng)硅膠孔注入37 ℃滅菌生理鹽水，總量100～250 mL，單次25～30 mL，50～100 mm Hg負(fù)壓吸引回收灌洗液(回收率至水40%～60%)。及時觀察患者反應(yīng)，如果不耐受或出現(xiàn)不良反應(yīng)，應(yīng)及時終止操作并對癥處理。取肺泡灌洗液30 mL，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取下層沉淀細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀對上皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和分離，顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行鑒定，細(xì)胞于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢測方法 主要步驟：實驗前配置上樣緩沖液、電泳緩沖液和轉(zhuǎn)膜緩沖液(根據(jù)操作步驟完成)，取樣品細(xì)胞10 μg充分洗滌后加入萃取試劑TRIzol裂解液反應(yīng)30 min，10 000 r/min離心10 min，重復(fù)加入TRIzol液和離心操作3次后，加入氯仿室溫靜置5 min，樣品分成3層，RNA位于上層水相中；轉(zhuǎn)移至新管，加入丙醇沉淀、離心、干燥、-80 ℃保存。經(jīng)電泳分析提取RNA產(chǎn)物，分光光度儀測定濃度，電泳條帶測定純度，符合實驗要求。然后合成cDNA作為轉(zhuǎn)錄模板，設(shè)計引物序列，MicroRNA-199a-5p:(F)5′-AAT TCG ATG AGG GAC CA-3′,(R)5′-TAT ATA TAC CCG GGA TAT-3′,326 bp;HIF-1α:(F)5′-ACC GGC GCG ATT TAT AT-3′,(R)5′-CCG GCA TAT ATC GCG-3′,123 bp;U6:(F)5′-GCG CGT ATA GGC GCG-3′,(R)5′-GGC GCG TTT ATA T-3′,86 bp。室溫下融解PCR Mix，冰上PCR擴增，體系包括PCR Mix 10 μL+正反引物各4 μL+cDNA 1 μL，添加反應(yīng)水至20 μL。反應(yīng)條件位95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火擴增40次循環(huán)，72 ℃ 15 s延伸。熔解曲線分析程序為72～95 ℃升溫0.5 ℃/次，恒溫10 s/次，降溫30 ℃ 30 s。結(jié)果以2-△△Ct法表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗;多組定量數(shù)據(jù)的比較采用方差分析的方法,多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗的方法，計數(shù)資料作χ2檢驗；Pearson檢驗分析MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平的相關(guān)性；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同分期和嚴(yán)重程度COPD患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達(dá)水平 急性期患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達(dá)水平(0.63±0.11)顯著高于穩(wěn)定期(0.37±0.08)，重度患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達(dá)水平(0.66±0.13)高于中度患者(0.35±0.07)，中度患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達(dá)水平(0.35±0.07)高于輕度患者(0.19±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：#P<0.05，與穩(wěn)定期比較；##P<0.05，與輕度比較；###P<0.05，與中度比較。

圖1不同分期和嚴(yán)重程度COPD患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達(dá)水平

2.2不同分期和嚴(yán)重程度COPD患者上皮細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平 急性期患者上皮細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平(0.52±0.13)顯著高于穩(wěn)定期患者(0.34±0.08)，重度患者HIF-1α mRNA表達(dá)水平(0.55±0.16)高于中度患者(0.32±0.06)，中度患者HIF-1α mRNA表達(dá)水平(0.32±0.06)高于輕度患者(0.16±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平的相關(guān)性 采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平在COPD穩(wěn)定期和急性期患者，輕度、中度和重度患者及總體患者中均呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

COPD的治療應(yīng)以預(yù)防為主，防治結(jié)合，COPD具有不可逆的氣流受限特點，早期以氣道高反應(yīng)性和炎性反應(yīng)為主，氣道上皮細(xì)胞分泌大量黏液蛋白成分，堵塞小氣道，造成吸氣和換氣功能下降[13]；長期發(fā)展可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞功能障礙，成纖維細(xì)胞增生，進(jìn)而導(dǎo)致氣道組織重塑，氣流受限不可逆，病情逐漸加重，臨床治療效果較差[14]。因此，在疾病的早期階段進(jìn)行強化干預(yù)可顯著改善疾病進(jìn)程，提高生活質(zhì)量。目前，臨床主要依賴肺功能進(jìn)行疾病分級和病情進(jìn)展程度判斷，靈敏度有待提高。該研究通過對COPD患者氣道灌洗液中起主要作用的上皮細(xì)胞功能檢測，其中MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)來探討疾病的發(fā)生機制。

研究結(jié)果提示，急性期患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定期，重度患者高于中度，中度患者高于輕度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MicroRNA-199a-5p是新近發(fā)現(xiàn)與COPD的發(fā)生有關(guān)的一種重要的非編碼RNA 分子，經(jīng)差異基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)[15]，其在COPD患者中表達(dá)明顯上調(diào)，與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。真核細(xì)胞體內(nèi)存在多種非編碼RNA 分子，主要與轉(zhuǎn)錄基因結(jié)合，調(diào)節(jié)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究顯示[16]，其功能可能在于調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的增殖和凋亡活性。但是具體的作用途經(jīng)還有待深入分析。HIF-1α在COPD的發(fā)生和發(fā)展階段發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)顯示[17-18]，COPD的病死率和住院天數(shù)與氣道黏液分泌量呈正相關(guān)，黏液分泌量是肺功能下降的獨立預(yù)測因子，上皮細(xì)胞作為主要的分泌來源，在受到氣道環(huán)境、病原微生物以及炎癥信號刺激下被激活，大量分泌黏液蛋白和炎癥介質(zhì)，參與氣道高反應(yīng)性、組織重塑和COPD的病理過程。HIF-1α可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞對缺氧環(huán)境的耐受性，主要通過影響一氧化氮合酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來實現(xiàn)[19]，內(nèi)皮細(xì)胞釋放活性NO降低，血管持續(xù)收縮，增加了氣道阻力；此外，還可以影響血管新生、促紅細(xì)胞生成素的生成來調(diào)節(jié)組織氧供[20-21]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可介導(dǎo)PI3K信號通路活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β和EGFR的表達(dá)，參與氣道炎性反應(yīng)和組織重塑[22-23]。該研究結(jié)果提示，急性期較穩(wěn)定期患者M(jìn)icroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)明顯增加，考慮與MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)上調(diào)明顯加重了氣道炎性反應(yīng)和高反應(yīng)性有關(guān)；同時，重度患者高于中度，中度高于輕度，提示MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)可持續(xù)作用于氣道上皮細(xì)胞，在疾病的發(fā)展進(jìn)程中表現(xiàn)更加突出。

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達(dá)水平在COPD穩(wěn)定期和急性期患者，輕度、中度和重度患者以及總體患者中均呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性。提示兩者可能在COPD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用，至于兩者間的內(nèi)在作用機制還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

綜上所述，COPD患者上皮細(xì)胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達(dá)上調(diào)與疾病分期和嚴(yán)重程度密切相關(guān)，兩者可能發(fā)揮協(xié)同作用關(guān)系。下一步可通過細(xì)胞或動物模型探討MicroRNA-199a-5p和HIF-1α的內(nèi)在作用機制，為COPD的早期防治提供新靶點。