P16、Ki-67蛋白表達(dá)及HPV檢測在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的意義*

張 坤，劉 慧，白 石

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州 221002；2.宿遷市鐘吾醫(yī)院病理科，江蘇宿遷 223800)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是婦科臨床上的一種最為常見的病癥之一，是與子宮頸癌有緊密聯(lián)系的一組癌前病變的統(tǒng)稱[1]。CIN反映的是一段宮頸癌前病變的連續(xù)過程，即由最初的宮頸不典型增生最終發(fā)展為浸潤性宮頸癌的一系列病理變化，由于其癌前病變過程較長，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的分類標(biāo)準(zhǔn)，可將CIN分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ3個等級[2]。其中，CINⅠ為輕度病變，約65%的患者可自行恢復(fù)，CINⅡ和CINⅢ為高度上皮內(nèi)瘤樣病變，需對患者采取有效的治療措施。近年來，宮頸癌在婦科臨床上呈高發(fā)態(tài)勢，已成為導(dǎo)致女性死亡的第二大惡性腫瘤，所以對宮頸癌患者需及早診斷并加以治療，但由于CIN的臨床特征不明顯，對CIN的鑒別診斷存在一定的困難。因此，探究一種CIN的早期診斷方法顯得尤為迫切?，F(xiàn)有研究表明，P16是一種抑癌基因，細(xì)胞內(nèi)的P16蛋白直接參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，P16蛋白的減少會導(dǎo)致細(xì)胞無限制增生，進(jìn)而引發(fā)癌變[3]；Ki-67是一種腫瘤增殖抗原，是判斷癌細(xì)胞增殖情況的一個重要指標(biāo)[4-6]，二者的表達(dá)情況對腫瘤細(xì)胞的判定具有重要意義。近年隨著流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒(HPV)具有致癌性[7]，并且HPV的感染與CIN的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。本研究旨在通過聯(lián)合檢測P16、Ki-67蛋白的表達(dá)及HPV的感染情況，進(jìn)而找到其與CIN的聯(lián)系，為臨床上CIN的診斷提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年2月來宿遷市鐘吾醫(yī)院進(jìn)行宮頸組織活檢或?qū)m頸LEEP術(shù)的患者160例作為研究對象。其中120例出現(xiàn)CIN患者作為觀察組。觀察組CINⅠ級36例，CINⅡ級43例，CINⅢ級41例。年齡26～61歲，平均(42.61±1.56)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)陰道鏡檢查和宮頸組織活檢確定為CIN的患者；(2)非HIV感染者，且患者無子宮內(nèi)膜病變史；(3)遵守醫(yī)學(xué)實驗倫理學(xué)原則，經(jīng)與患者和家屬溝通，其自愿簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期或哺乳期內(nèi)的患者；(2)就診前半個月內(nèi)發(fā)生過感染性疾??；(3)合并有器官衰竭，肝、腎疾病和其他腫瘤疾病史；(4)宮頸組織活檢前進(jìn)行過化療或者放療的患者。對照組為40例正常宮頸黏膜上皮組織的患者，平均(43.25±1.25)歲，無肝、腎疾病，無腫瘤史。對照組與觀察組在年齡等方面比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 即用型P16鼠單克隆抗體和即用型Ki-67鼠單克隆抗體購自賽默飛世爾科技有限公司，SP廣譜超敏試劑盒、PBS液和DAB過氧化物酶顯色底物劑等購自北京中杉生物科技有限公司，HPV-DNA檢測試劑盒、基因雜交信號放大儀和自動恒溫加熱器等購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測P16和Ki-67 實驗中所用標(biāo)本先由10%的甲醛溶液固定，用HE染色經(jīng)顯微鏡觀察后嚴(yán)格挑選得出。采用免疫組化SP法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書的步驟進(jìn)行。結(jié)果判斷根據(jù)切片中陽性細(xì)胞的染色情況，P16陽性細(xì)胞為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki-67陽性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。在高倍鏡下于染色區(qū)域隨機(jī)選擇5個視野，共計數(shù)500個腫瘤細(xì)胞，分別計算P16和Ki-67細(xì)胞陽性率。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞陽性率小于5%為陰性(-),5%～<25%為弱陽性(+)，25%～<50%為中等陽性(++)，≥50%為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3.2HPV檢測 采用Digene公司推出的第二代雜交捕獲實驗(HC2)測定HPV-DNA水平，詳細(xì)操作嚴(yán)格按照儀器和試劑盒的使用說明書的步驟執(zhí)行。檢測結(jié)果依據(jù)HPV-DNA水平分為陽性和陰性，其中HPV-DNA≥1.0 pg/mL為陽性(+)，HPV-DNA<1.0 pg/mL為陰性(-)。

2 結(jié) 果

2.1P16和Ki-67的表達(dá)情況及相關(guān)性 對照組P16、Ki-67陽性率分別為7.50%(3/40)、15.00%(6/40)；觀察組P16、Ki-67的總陽性率分別為85.00%(102/120)、92.50%(111/120)，觀察組P16、Ki-67陽性率明顯高于對照組，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從觀察組內(nèi)來看，CINⅠ患者P16陰性表達(dá)最多，P16陽性表達(dá)中主要是以弱陽性為主，Ki-67的表達(dá)則是弱陽性最多；而CINⅡ和CINⅢ患者P16、Ki-67的表達(dá)絕大部分都是陽性，且強(qiáng)陽性的表達(dá)例數(shù)最多。據(jù)此可分析得出：P16與Ki-67在CIN中的表達(dá)與CIN的分級呈正相關(guān)(r=1.000,P<0.05)，且P16和Ki-67的強(qiáng)陽性表達(dá)提示著高度宮頸上皮內(nèi)瘤變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CINⅠ患者P16、Ki-67陽性率,明顯低于CINⅡ和CINⅢ患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 兩組中P16表達(dá)情況比較

P16和Ki-67在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變的表達(dá)情況見表3。可以看出，在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者中，P16和Ki-67都表達(dá)為陽性的數(shù)量最多，且二者均表達(dá)為陰性的情況不存在，提示P16和Ki-67的高表達(dá)與高度宮頸上皮內(nèi)瘤變有關(guān)。將P16和Ki-67的陰性表達(dá)記為0，弱陽性表達(dá)記為1，中等陽性表達(dá)記為2，強(qiáng)陽性表達(dá)記為3，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析后得出以下結(jié)論：在本研究中，對照組和CINⅠ患者的P16、Ki-67表達(dá)不具有相關(guān)性。在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變中(CINⅡ和CINⅢ)，P16和Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.785，P<0.05)

表2 兩組中Ki-67表達(dá)情況比較

表3 高度宮頸上皮內(nèi)瘤變中P16和Ki-67的表達(dá)情況

2.2HPV檢測情況 觀察組HPV總陽性率為81.67%(98/120)，而對照組HPV陽性率僅有12.50%(5/40)，觀察組陽性率明顯高于對照組，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從觀察組來看，CINⅠ患者HPV陰性的例數(shù)有13例，隨著CIN病變級別的升高，HPV陰性的例數(shù)驟降至6例和3例，HPV陽性率隨之逐漸升高，將高度宮頸上皮內(nèi)瘤變與低度宮頸上皮內(nèi)瘤變中HPV陽性率對比，發(fā)現(xiàn)二者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。經(jīng)Spearman法分析后還發(fā)現(xiàn)，在觀察組中HPV陽性率與P16蛋白的表達(dá)情況呈正相關(guān)(r=0.486，P<0.05)。

表4 HPV-DNA的表達(dá)情況

3 討 論

子宮頸癌目前在我國已成為危害婦女健康的第二大惡性腫瘤，但現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)對其發(fā)生率的影響有限，所以目前子宮頸癌的防治有賴于對其進(jìn)行行之有效的人群篩查[8]。CIN反映的是一段浸潤性宮頸癌的癌前病變過程，CIN與宮頸癌的發(fā)生有著極其密切的關(guān)系，因此CIN的準(zhǔn)確診斷對婦科臨床尤其是宮頸癌的防治有著重要的意義。但由于CIN的臨床特征不明顯，所以僅憑臨床癥狀來診斷CIN十分困難。近年來的研究表明，P16和Ki-67的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖息息相關(guān)，且HPV的感染是導(dǎo)致CIN的重要因素。

P16基因是一種抑癌基因，其編碼的產(chǎn)物P16蛋白直接作用于細(xì)胞周期。P16蛋白可抑制細(xì)胞周期依賴酶CDK4的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。若P16基因突變或缺失，則CDK4的活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起細(xì)胞分裂加速，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[9-10]。在本研究中，觀察組的P16陽性率(85.00%)，明顯高于對照組陽性率(7.50%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而且在觀察組中CINⅡ和CINⅢ患者P16陽性率明顯高于CINⅠ患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。推測P16與CIN有著緊密的聯(lián)系，P16的陽性表達(dá)可視為CIN發(fā)生的危險因素，且P16的陽性率隨CIN病變程度的加深而增高。Ki-67是一種位于細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白，其作用于細(xì)胞分裂的G1、S、G2、M期[11-12]，Ki-67在細(xì)胞中表達(dá)越高，表明細(xì)胞增殖越快，細(xì)胞分化越差[13]，研究已證實Ki-67可作為判斷腫瘤細(xì)胞增殖能力的標(biāo)記物。在本研究中，觀察組Ki-67的陽性率，明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，推測Ki-67的陽性表達(dá)是CIN發(fā)生的標(biāo)志之一。從觀察組來看，輕度宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的Ki-67陽性率較低，且強(qiáng)陽性和中等陽性的表達(dá)例數(shù)較少；而高度宮頸上皮內(nèi)瘤變患者Ki-67陽性率較高，且強(qiáng)陽性和中等陽性的例數(shù)較CINⅠ型有明顯的增多，可推知Ki-67的表達(dá)水平隨CIN的發(fā)展而增強(qiáng)。經(jīng)相關(guān)性分析得知在高度上皮內(nèi)瘤變中P16與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.785,P<0.05)，在低度宮頸上皮內(nèi)瘤變中不相關(guān)，相關(guān)研究表明這是由于二者在細(xì)胞增殖的不同階段表達(dá)的情況不同[13]，據(jù)此推測P16和Ki-67蛋白表達(dá)的差異還可以作為CIN病變程度的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，而且兩種蛋白在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)水平存在一定的聯(lián)系。所以，聯(lián)合檢測P16與Ki-67的表達(dá)情況有助于提高CIN診斷的準(zhǔn)確率。

HPV是一種環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)的病毒，目前已有研究證實HPV感染是引發(fā)宮頸癌的最主要因素[14-16]，本研究中，觀察組與對照組HPV陽性率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明HPV的感染是誘發(fā)CIN的因素，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在觀察組內(nèi)HPV的陽性率隨CIN的發(fā)展而升高，推測HPV的感染推進(jìn)宮頸病變的加重。研究中還發(fā)現(xiàn)，HPV陽性率與P16蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.486,P<0.05)，說明P16的表達(dá)與HPV的感染有關(guān)，且HPV的感染推動著P16蛋白的高表達(dá)，臨床上對CIN的診斷及預(yù)后可將HPV的陽性率作為重要指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過檢測P16、Ki-67蛋白的表達(dá)情況來說明了二者的陽性表達(dá)與CIN的密切關(guān)系，進(jìn)一步證實了兩種蛋白在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變中的相關(guān)性，但未能具體說明低度宮頸上皮內(nèi)瘤變中P16、Ki-67蛋白表達(dá)情況不相關(guān)的原因。實驗還通過對HPV-DNA的檢測來說明了HPV的感染是誘發(fā)CIN的重要原因，并發(fā)現(xiàn)HPV的感染推動著P16蛋白的表達(dá)，但HPV與P16蛋白二者存在相關(guān)性的證據(jù)還需進(jìn)一步探究。與以往的研究相比，此次研究不僅證實了P16、Ki-67蛋白表達(dá)情況的差異與CIN的病變程度的關(guān)系，還進(jìn)一步探究了HPV在CIN中的作用機(jī)制，為臨床上CIN的檢測與分型提供了新的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

以上實驗表明，HPV的感染是誘發(fā)CIN的重要因素，P16和Ki-67的陽性表達(dá)可作為判斷CIN發(fā)生的提示因素，且在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變中P16與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)。通過聯(lián)合檢測HPV-DNA、P16和Ki-67的表達(dá)情況可作為判斷CIN的發(fā)生的新依據(jù)。本研究證實了聯(lián)合檢測P16、Ki-67及HPV的表達(dá)不僅能提高CIN診斷的準(zhǔn)確率，并能進(jìn)一步鑒別CIN的病變程度，對CIN的臨床診斷及篩查有重要價值。