GRHL2沉默對肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響

魏明莉 黃娜

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內科610500

肺癌是全球頭號癌癥殺手,嚴重威脅著人類的生存健康。2018年Bray等[1]對全球癌癥數(shù)據的統(tǒng)計表明,肺癌是發(fā)病率和病死率第1位的惡性腫瘤。同時,肺癌的發(fā)病率和病死率居我國所有惡性腫瘤之首[2]。其中肺腺癌的發(fā)病率越來越高,是我國最常見的肺癌病理類型。肺癌是一種基因性疾病,癌基因的激活或抑癌基因的失活導致細胞異常增殖和凋亡障礙是肺癌發(fā)生的關鍵,也是癌細胞產生耐藥性的機制之一[3]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)GRHL2在乳腺癌、結直腸癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調節(jié)作用[4-6],但GRHL2在肺癌細胞中的作用尚未完全明確。為進一步闡明GRHL2在肺癌中的作用,本研究通過慢病毒介導的GRHL2沉默表達,初步探討GRHL2沉默對肺癌A549細胞細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞株及293T細胞由成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。胎牛血清購自美國Thermo Scientific公司。GRHL2兔多克隆抗體購自英國Abcam公司,β-actin兔多抗購自美國CST公司,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。Annexin V-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自中國南京凱基生物科技公司。實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)逆轉錄及熒光定量試劑盒購自美國BIO-RAD公司。GRHL2及β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GRHL2沉默慢病毒穩(wěn)定細胞株的構建根據Genebank中報道的人GRHL2基因的核苷酸序列(NM_024915),參照siRNA設計原則,設計一條19 nt寡核苷酸的特異性siRNA靶序列(5'-TTCAAAGCAGATGAAAGAA-3'),合成sh RNA,sh RNA轉錄模板如下。正向引物:5'-CCGGCCTTCAAAGCAGATGAAAGAACTCGAGTTCTTTCATCTGCTTTGAAGGTTTTTG-3',反向引物:5'-AATTCAAAAACCTTCAAAGCAGATGAAAGAACTCGAGTTCTTTCATCTGCTTTGAAGG-3'。sh RNA模 板中的loop結 構選用CTCGAG,sh RNA的轉錄終止序列采用T6結構。正向引物模板5'端添加了CCGG,與AgeⅠ酶切后形成的粘端互補;反向引物模板5'端添加了AATT,與EcoRⅠ酶切后形成的粘端互補。采用GV248干擾載體構建GRHL2-sh RNA表達載體,使用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切GV248載體以使其線性化,之后利用T4連接酶將其與退火的雙鏈oligo于16℃連接過夜,之后轉化大腸桿菌菌株DH5α,挑取重組陽性克隆行PCR及測序鑒定,然后將GV248重組載體、p GC-LV載體、p Helper 1.0載體、p Helper 2.0載體制備慢病毒包裝系統(tǒng),轉染293T細胞,包裝成GRHL2沉默慢病毒,其對應的空載慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司提供。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染 將A549細胞分為3個組,實驗組:GRHL2沉默慢病毒感染的A549細胞系;陰性對照組:空載慢病毒感染的A549細胞系;空白對照組:不給予任何處理的A549細胞系。在感染前24 h,將處于對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜,待細胞的匯合度為30%～40%后,根據A549細胞的復感染指數(shù),在實驗組和陰性對照組中分別加入相應的病毒上清液,同時加入終濃度為8 mg/L的凝聚胺以增加感染效率,感染24 h后更換為含1 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每24 h采用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強度和細胞存活狀態(tài),在熒光顯微鏡下檢測感染率,收取感染效率在80%以上的細胞作為目的細胞。

1.2.3 GRHL2表達的檢測

1.2.3.1 q RT-PCR檢 測GRHL2 mRNA表 達 取空白對照組、陰性對照組、實驗組中細胞各1×106個,按照Trizol試劑盒說明提取總RNA,采用反轉錄試劑盒合成cDNA,然后以c DNA為模板,采用qRT-PCR檢測3組細胞GRHL2 m RNA的表達水平,以β-actin為內參。反應條件:95℃30 s;95℃10 s,60℃30 s,40個循環(huán)。GRHL2正向引物5'-AGCCTGAGCACTGTGGAGTT-3',GRHL2反向引物5'-GCTGCTGGCCTGAATGTAAT-3';β-actin正 向 引 物5'-CCTGGCACC-CAGCACAAT-3',β-actin反向引物5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。相對基因表達水平用2-ΔΔCt分析法進行分析,ΔCt=目的基因Ct值-β-actin Ct值;ΔΔCt=各樣品ΔCt-空白對照組ΔCt平均值。重復3次,取均值。

1.2.3.2 蛋白質印跡法(Western blot)檢測GRHL2蛋白質的表達 收取空白對照組、陰性對照組、實驗組中細胞各1×106個,提取總蛋白。通過BCA法進行蛋白定量,然后經常規(guī)10%SDS-PAGE凝膠電泳、轉PVDF膜和蛋白印跡反應。GRHL2抗 體(1∶2 000)和 β-actin抗 體(1∶1 000)4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h后用ECL顯色液曝光。重復3次,取均值。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的3組細胞經胰酶消化后,完全培養(yǎng)基重懸制備成細胞懸液,每孔100μl細胞懸液接種于96孔板上(細胞計數(shù):2×103/孔),每組3個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～6 d,每天固定時間于酶標儀下測量細胞生長狀況。測量前,將10μl CCK-8試劑加入待測孔,輕輕振搖96孔板后,放入5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h。酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。重復3次,取均值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化收集3組細胞,用冷PBS輕輕洗滌細胞2次,離心半徑7 cm,2 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)基后收集5×105個細胞,加入500μl的連接緩沖液用于重懸收集的細胞。先后加入5μl Annexin V-APC和5μl PI染液后混勻。室溫下避光反應15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡。重復3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用Origin 8.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,多組間比較用單因素方差分析,2組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒穩(wěn)定細胞株熒光顯微鏡下觀察結果各組細胞熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達結果見圖1。陰性對照組、實驗組的細胞中GFP表達比例達80%以上,而空白對照組細胞中無GFP表達。

2.2 qRT-PCR、Western blot驗證GRHL2在人肺腺癌A549細胞中沉默表達成功 各組細胞中GRHL2的m RNA表達水平如圖2所示,結果發(fā)現(xiàn):實驗組中A549細胞的GRHL2 mRNA表達水平較空白對照組顯著下降(t=0.48,P＜0.05),而陰性對照組中A549細胞的GRHL2 m RNA表達水平無明顯變化(t=0.81,P＞0.05)。通過Western blot分析,同樣發(fā)現(xiàn)實驗組中GRHL2的蛋白質表達水平相比空白對照組和陰性對照組均明顯下降(F=42.57,P＜0.05),而空白對照組和陰性對照組GRHL2蛋白質表達水平差異無統(tǒng)計學意義(t=1.24,P＞0.05),見圖3。

圖1 各組細胞綠色熒光蛋白的表達情況 ×200

圖2 各組A549細胞中GRHL2 m RNA的表達變化

2.3 GRHL2沉默抑制人肺腺癌A549細胞增殖 采用CCK-8檢測細胞的生長情況,根據細胞的生長狀況,繪制細胞增殖曲線圖(圖4)。結果顯示,A549細胞培養(yǎng)2 d,實驗組細胞的增殖速度下降,但3組比較差異無統(tǒng)計學意義(F=2.13,P＞0.05),而在3～6 d,實驗組較陰性對照組、空白對照組細胞生長明顯抑制(F=65.64,P＜0.05)。在3～6 d,陰性對照組與空白對照組細胞增殖速度差異無統(tǒng)計學意義(t=0.75,P＞0.05)。

圖3 各組A549細胞中GRHL2蛋白的表達變化

2.4 GRHL2沉默促進人肺腺癌A549細胞凋亡 采用流式細胞儀對3組細胞凋亡率進行檢測,實驗組細胞凋亡率明顯高于陰性對照組及空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F=56.76,P＜0.05),見圖5、6。陰性對照組和空白對照組細胞凋亡率較低,2組之間差異無統(tǒng)計學意義(t=1.08,P＞0.05)。

圖4 GRHL2沉默對A549細胞增殖能力的影響

圖6 GRHL2沉默對A549細胞凋亡的影響

3 討論

圖5 流式細胞術檢測3組細胞凋亡情況 A:空白對照組;B:陰性對照組;C:實驗組

肺癌早期癥狀不典型,大部分在確診時已處于中晚期,失去手術治療的機會,化療及放療是目前肺癌治療的主要方法,但已達瓶頸期,無突破性進展?；虬邢蛑委煘榉伟┲委熖峁┝诵碌姆绞?。慢病毒是一種功能強大逆轉錄病毒,它可以將目的基因安全有效的植入到宿主細胞DNA中,可感染或轉染幾乎所有的哺乳類動物細胞,并在其中持續(xù)穩(wěn)定的表達[7],起到了很好的基因治療效果。因此,在各種體內外實驗中,它成為了基因遞送最有效的載體之一,在腫瘤的分子靶向研究方面獲得了廣泛的應用[8-10],為腫瘤的基因靶向治療提供了更廣闊的前景。

GRHL是哺乳動物所具有的一種似果蠅粒狀頭樣轉錄因子,目前發(fā)現(xiàn),GRHL家族包括GRHL1/2/3 3種亞型,它們表現(xiàn)出序列和生物化學方面的相似性[11-12]。其中GRHL2參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。GRHL2通過轉錄調控靶基因,如端 粒 酶、P63、Wnt、TGF-β、mir200、ZEB1、OVOL2、p300等,在細胞增殖和分化中起到獨特作用[13]。GRHL2沉默表達顯著抑制體外細胞增殖和體內腫瘤的發(fā)生,其分子機制涉及對ZEB1和E-cadherin的調控作用[14]。目前GRHL2與肺癌的研究較少,有文獻報道GRHL2通過調節(jié)RhoG轉錄活性抑制非小細胞肺癌轉移[15]。

本研究將GRHL2沉默慢病毒感染肺腺癌A549細胞,通過熒光顯微鏡觀察GFP表達情況,表明GRHL2沉默慢病毒及其空載慢病毒成功感染A549細胞并穩(wěn)定表達,并經q RT-PCR和Western blot驗證,對照組慢病毒感染A549細胞對GRHL2表達無明顯影響,建立了GRHL2沉默慢病毒A549穩(wěn)定細胞株。同時,本研究通過體外實驗證實對照組慢病毒感染對A549細胞增殖、凋亡無明顯影響,而GRHL2沉默抑制A549細胞的增殖,促進其凋亡。Paltoglou等[16]研究表明,GRHL2促進前列腺癌的生長,敲低GRHL2抑制前列腺癌細胞增殖。Kang等[17]發(fā)現(xiàn)敲除GRHL2基因使h TERT啟動子活性顯著降低,減少端粒酶活性和抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖能力。Faddaoui等[18]研究表明,抑制GRHL2基因的表達,抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移。但是,Xiang等[19]研究表明,GRHL2明顯降低c-Myc和Bcl-2蛋白的表達水平,抑制胃癌細胞增殖。Werner等[20]研究表明,GRHL2在乳腺癌中具有雙重調節(jié)作用,既可以促進乳腺癌細胞的增殖,又可以抑制EMT相關乳腺癌細胞的生長。本研究結果與前三項研究[16-18]一致,而與Werner等[20]相悖。產生這一差異的原因可能是GRHL2在不同腫瘤細胞中,甚至在同一腫瘤細胞中發(fā)揮不同的作用,其具體機制仍有待進一步研究。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn),慢病毒介導的GRHL2沉默表達抑制了肺癌A549細胞的增殖,促進其凋亡,由此可見GRHL2對肺癌細胞的生長具有重要的調節(jié)作用,但其作用機制尚不明確。筆者將進一步通過體內實驗驗證GRHL2對肺癌的影響,以期為肺癌的治療提供新的分子靶標。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突