文峪河上游河岸帶不同植被類型土壤nirS反硝化菌群結(jié)構(gòu)及功能

韓曉麗,黃春國(guó),張蕓香,郭晉平,*

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué),林學(xué)院,太谷 030801 2 北方功能油料樹(shù)種培育與研發(fā)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太谷 030801 3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801

河岸帶植物群落是介于河流生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)之間的關(guān)鍵功能型森林群落系統(tǒng),是二者之間進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化和信息交換的重要過(guò)渡區(qū)域,在維持流域景觀穩(wěn)定性和生態(tài)安全方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。河岸帶植物群落演替過(guò)程,不僅受河岸帶高度復(fù)雜地形地貌等生境條件影響,還受到洪水引起的侵蝕和沉積的干擾[4],使得整個(gè)流域河岸帶植物群落類型呈現(xiàn)出明顯的演替差異。而處于不同演替階段的河岸帶植被類型,對(duì)整個(gè)流域生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮著獨(dú)特的水文功能和生態(tài)功能[5-6]。

為闡明文峪河上游河岸帶氮素濾除機(jī)制,特別是反硝化作用及其影響的環(huán)境因子間的作用關(guān)系。本文以該地區(qū)河岸帶不同演替階段的植被類型為研究對(duì)象,對(duì)土壤主要理化性質(zhì)、反硝化菌群多樣性及群落組成和反硝化酶活性等進(jìn)行分析,揭示不同植被類型土壤反硝化菌群多樣性及群落組成和反硝化酶活性變化規(guī)律,并解析差異變化與土壤主要理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性,闡明土壤反硝化菌群多樣性及群落組成與河岸帶植物群落演替的控制關(guān)系,為進(jìn)一步研究該區(qū)域河岸帶氮素循環(huán)及水體污染防治提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

文峪河,屬于黃河支流汾河的支流,全長(zhǎng)155 km,其上游段自發(fā)源地關(guān)帝山主峰孝文山南麓龐泉溝起始至文峪河水庫(kù)一段,稱中西河,位于呂梁山脈中段關(guān)帝山林區(qū)的龐泉溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。該保護(hù)區(qū)位于山西省交城、文水、方山、婁煩等縣交界處,地理坐標(biāo)為111°22′—111°33′ E,37°45′—37°55′ N,海拔1600—2831 m。氣候?qū)儆谑芗撅L(fēng)影響和控制的暖溫帶大陸性山地氣候,年平均氣溫4.2 ℃,年平均降雨量822.6 mm,主要集中在7—9月,占全年總量的83%以上。土壤類型從低海拔到高海拔(1650—2830 m)依次為山地褐土、山地淋溶褐土、山地棕壤和亞高山草甸土。區(qū)域內(nèi)植物物種多樣性較高,有種子植物89科359屬809種[14]；其中河岸帶植被優(yōu)勢(shì)植物有青杄 (Piceawilsonii)、白杄 (P.meyeri)、華北落葉松 (Larixprincipis-rupprechtii)、白樺 (Betulaplatyphylla)、山楊 (PopuluscathayanaRehd.)、沙棘 (Hippophaerhamnoides)、密齒柳 (SalixcharacterSchneid)等[4,15]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和采樣

根據(jù)已有的調(diào)查數(shù)據(jù)和圖面材料,結(jié)合實(shí)地踏查,于2016年在文峪河上游主河道及支流人為干擾較少的地段,選址設(shè)置8種具代表類型的河岸植被類型樣地,每種類型選取立地條件相似的3個(gè)樣地重復(fù),每個(gè)樣地內(nèi)設(shè)置3個(gè)樣方,喬木20 m×20 m,灌木10 m×10 m,草本2 m×2 m,樣方間距大于10 m,樣方內(nèi)使用“S”型5點(diǎn)采樣法,清除土壤表層雜質(zhì)后,采取0—15 cm(A層)和15—30 cm(B層)不同土層土樣,分別分層將5處土壤并混合為一個(gè)土樣。樣品放置于冰袋冷藏箱中運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)土樣進(jìn)行過(guò)篩(2 mm)并混勻,去除植物根系和石頭等雜質(zhì)。再采用四分法將每個(gè)土樣分為兩份,一份室內(nèi)風(fēng)干用于測(cè)定土壤理化指標(biāo),一份保存于-70℃冰箱內(nèi)用于土壤反硝化菌群多樣性及群落組成的測(cè)定。

同時(shí),依據(jù)高潤(rùn)梅[4]和吉久昌等[15]關(guān)于文峪河上游河岸林演替分析及群落類型研究結(jié)果,將本實(shí)驗(yàn)8種植被類型歸類為6個(gè)演替階段,即：五花草甸(WH, Multi-flower meadow)屬于演替I階段、沙棘灌木林(HR, Hippophae shrub)和柳樹(shù)灌木林(SS, Salix shrub)群落類型屬于演替II階段、山楊林群落類型(PC, Poplar forest)和山楊白樺混交林(PQ, Poplar birch forest)屬于演替III階段、山楊白樺落葉松混交林(PQL, Poplar birch and larix forest)屬于演替IV階段、落葉松云杉混交林(LP, Larix and picea forest)屬于演替V階段、云杉林群落類型(PM, Picea forest)屬于演替VI階段。樣地基本概況見(jiàn)表1。

表1 文峪河上游河岸帶不同植被類型采樣地概況及優(yōu)勢(shì)植物種

1.3 數(shù)據(jù)測(cè)定及分析

土壤反硝化菌群多樣性及群落組成采用第二代高通量測(cè)序平臺(tái) (Illumina Miseq)進(jìn)行測(cè)序分析。PCR擴(kuò)增采用的是nirS基因引物：Cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)；擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 μL的純化DNA,5 μL的Q5反應(yīng)緩沖液(5×),5 μL的Q5高保真GC緩沖液(5×),0.25 μL的Q5高保真DNA聚合酶(5U/μL),2 μL的dNTPs液(2.5 mmol/L),上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL,8.75 μL的去離子水；擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2 min,98℃變性15 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸30 sec,25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。運(yùn)用uclust軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類,序列相似性定位0.97,操作分類單元被認(rèn)為可能接近于屬。使用QIIME軟件和R語(yǔ)言軟件包(v3.6.1)進(jìn)行反硝化菌群Alpha多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤反硝化酶活性和菌群多樣性及群落組成等數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析和多重比較,以及Spearman相關(guān)性分析；使用R 3.6.1(vegan)軟件包對(duì)不同植被類型的土壤理化性質(zhì)與反硝化菌群多樣性及群落組成進(jìn)行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型及土層間土壤理化性質(zhì)

不同植被類型土壤理化性質(zhì)存在較大差異(表2),五花草甸(WH)型土壤pH顯著高于其他植被類型,土壤有機(jī)碳(SOC)、速效磷(AP)、土壤含水量(SM)和土壤全氮(TN)等卻較低；柳樹(shù)灌木林(SS)土壤全氮(TN)較高,而土壤pH值和銨態(tài)氮含量較低；山楊白樺混交林(PQ)土壤銨態(tài)氮較高；落葉松云杉混交林(LP)土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤含水量(SM)較高；云杉林(PM)土壤速效磷(AP)和土壤含水量(SM)較高。同時(shí),土壤理化性質(zhì)在不同土層間差異顯著。0—15 cm土層土壤有機(jī)碳(SOC)含量、速效磷(AP)、土壤含水量(SM)、全氮(TN)和銨態(tài)氮顯著高于15—30 cm土壤層,但土壤pH顯著低于15—30 cm土壤。另外,土壤硝態(tài)氮受植被類型和土層相互作用的影響(圖1)。其中柳樹(shù)灌木林(SS)群落類型0—15 cm土層硝態(tài)氮含量顯著性高于其他植被類型的各個(gè)土層,山楊林(PC) 0—15 cm及15—30 cm土層、五花草甸(WH) 15—30 cm土層硝態(tài)氮含量較低,且相互之間差異不顯著。

表2 文峪河上游不同植被類型和土層土壤理化性質(zhì)

植被類型×土層交互作用不顯著,但主因子作用均顯著。表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同一列中不同字母表示彼此在P≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)；小寫字母表示不同植被類型間差異顯著,大寫字母表示不同土層間差異顯著

圖1 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤硝態(tài)氮含量Fig.1 Soil nitrate content in different riparian vegetations and soil layers of upper Wenyuhe watershed 植被類型×土層交互作用顯著(P≤0.05). 圖中誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差,每個(gè)柱上方字母表示彼此在P ≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法);WH：五花草甸Multi-flower meadow；HR：沙棘灌木林Hippophae shrub；SS：柳樹(shù)灌木林Salix shrub； PC：山楊林Poplar forest；PQ：山楊白樺林Poplar birch forest； PQL：山楊白樺落葉松林Poplar birch and larix forest； LP：落葉松云杉林Larix and picea forest；PM：云杉林 Picea forest

2.2 不同植被類型及土層間土壤反硝化菌群多樣性及反硝化酶活性

土壤反硝化菌群多樣性受植被類型和土層相互作用的影響(圖2)。沙棘灌木林(HR)15—30 cm土層反硝化菌群多樣性Chao1指數(shù)顯著高于其他植被類型各土層,山楊白樺落葉松林 (PQL)15—30 cm土層Chao1指數(shù)最低；云杉林(PM) 0—15 cm土層、山楊白樺落葉松林(PQL) 0—15 cm土層和五花草甸(WH)15—30 cm土層Shannon指數(shù)最高,山楊白樺落葉松林(PQL)15—30 cm土層最低,且差異顯著。結(jié)合植被類型演替分析,土壤反硝化菌群多樣性指數(shù)變化大致呈“W”型趨勢(shì),即五花草甸(WH)(演替I期)、山楊白樺林(PQ)(演替III期)和云杉林(PM)(演替VI期)土壤反硝化菌群多樣性較高。

圖2 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤中反硝化菌群多樣性Fig.2 Soil denitrifying bacterial diversity in different riparian vegetations and soil layers of upper Wenyuhe watershed 植被類型×土層交互作用顯著(P≤0.05). 圖中誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差,每個(gè)柱上方字母表示彼此在P≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)

土壤反硝化酶活性是反映土壤反硝化功能重要指標(biāo)。由圖3可知,土壤反硝化酶活性受植被類型和土層相互作用的影響,演替II階段,沙棘灌木林(HR)和柳樹(shù)灌木林(SS) 0—15 cm土層土壤反硝化酶活性最高,其15—30 cm土層土壤反硝化酶活性次之,且二者之間差異不顯著。即與其他植被類型相比,沙棘灌木林(HR)和柳樹(shù)灌木林(SS)土壤反硝化功能較強(qiáng)。結(jié)合植被類型演替分析,土壤反硝化酶活性變化呈倒“V”型趨勢(shì),即演替II期的沙棘灌木林(HR)和柳樹(shù)灌木林(SS)土壤反硝化酶活性較強(qiáng)。

圖3 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤反硝化酶活性Fig.3 Denitrifying enzyme activity in different riparian vegetation and soil layers of upper Wenyuhe watershed植被類型×土層交互作用顯著(P≤0.05). 圖中誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差,每個(gè)柱上方字母表示彼此在 P≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)

2.3 不同植被類型及土層間土壤反硝化菌群落組成及優(yōu)勢(shì)菌群

土壤反硝化菌群落組成及優(yōu)勢(shì)菌群受植被類型和土層相互作用影響。由圖4可知,門水平上,土壤反硝化菌群落組成主要包括了變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)。其中,變形菌門(Proteobacteria)在柳樹(shù)灌木林0—15 cm土層(SSA)土壤中相對(duì)豐度最高,屬于優(yōu)勢(shì)菌群,厚壁菌門(Firmicutes)是五花草甸0—15 cm土層(WHA)優(yōu)勢(shì)菌群,放線菌門(Actinobacteria)在沙棘灌木林0—15 cm土層(HRA)和柳樹(shù)灌木林0—15 cm土層(SSA)屬于優(yōu)勢(shì)菌群,綠彎菌門(Chloroflexi)是山楊白樺落葉松林混交林0—15 cm土層(PQLA)優(yōu)勢(shì)菌群；而浮霉菌門(Planctomycetes)僅在落葉松云杉混交林15—30 cm土層(LPB)和云杉林15—30 cm土層(PMB)土壤中有分布,且二者之間差異不顯著。同時(shí),柳樹(shù)灌木林15—30 cm土層(SSB)和云杉林15—30 cm土層(PMB)土壤反硝化菌群落組成較豐富,均含有四種不同門的反硝化菌群。其中,柳樹(shù)灌木林15—30 cm土層(SSB)除變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群外,仍含有少量的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)；云杉林15—30 cm土層(PMB)土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為變形桿菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)；而演替III期山楊林(PC)和山楊白樺混交林(PQ)土壤中反硝化菌群落組成較稀少,僅含有變形桿菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)；云杉林0—15 cm土層(PMA)僅有變形桿菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。

圖4 文峪河上游河岸不同植被類型土壤nirS 型反硝化菌群相對(duì)豐度組成(門水平)Fig.4 Composition and abundance of nirS denitrifiers at phylum level of different riparian vegetations of upper Wenyuhe watershed柱內(nèi)字母分別表示同一反硝化細(xì)菌門在不同植被類型及土層樣本間相對(duì)豐度在 P≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)；橫坐標(biāo)標(biāo)簽后加A表示0—15 cm土層；加B表示15—30 cm土層

在屬水平上,對(duì)相對(duì)豐度前10的屬進(jìn)行分析可知(表3)：五花草甸土壤中芽孢桿菌屬(Bacillus)在0—15 cm土層相對(duì)豐度含量較高,貪銅菌屬(Cupriavidus)在15—30 cm土層較高；沙棘灌木林中固氮菌屬(Azoarcus)和硫針菌屬(Sulfuritalea)在0—15 cm土層中相對(duì)豐度較高,紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)在15—30 cm土層中相對(duì)豐度較高；柳樹(shù)灌木林0—15 cm土層(SSA)中羅河桿菌屬(Rhodanobacter)較高；山楊白樺混交林土壤中固氮螺菌屬(Azospirillum)和多形菌屬(Polymorphum)在0—15 cm土層相對(duì)豐度較高,假單孢菌屬(Pseudomonas)在15—30 cm土層含量較高；落葉松云杉混交林土壤中紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)在0—15 cm土層中含量較高,固氮螺菌屬(Azospira)在15—30 cm土層中相對(duì)豐度較高；云杉林土壤中貪銅菌屬(Cupriavidus)在15—30 cm土層中相對(duì)豐度較高。

表3 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤中反硝化菌的相對(duì)豐度差異(屬水平)

Table 3 Abundance of soil denitrifying bacterial (nirS) at genus leve as influenced by vegetation types and soil layers in upper Wenyuhe watershed (2-way ANOVA)

植被類型Vegetation types優(yōu)勢(shì)種屬 Dominant genera假單胞菌屬Pseudomonas固氮螺菌屬Azospirillum固氮螺菌屬Azospira紅長(zhǎng)命菌屬Rubrivivax羅河桿菌屬Rhodanobacter五花草甸 0—15 cm (WHA)0.14d0.31b0.02fgh0.01j 0.09d沙棘灌木林 0—15 cm (HRA)0.02h0.12e0.10d0.09cd0.05ef柳樹(shù)灌木林 0—15 cm (SSA)0.14d0.02gh 0.19c0.12ab0.21a山楊林 0—15 cm (PCA)0.32b0.18d0.01fgh0.08def0.04gh山楊白樺混交林 0—15 cm (PQA)0.06fg0.33a 0.07de0.03i 0.05fg山楊白樺落葉松混交林 0—15 cm (PQLA)0.18c0.00h 0.00h0.09de0.00i落葉松云杉混交林 0—15 cm (LPA)0.04gh0.02g 0.24b 0.13a0.14b云杉林 0—15 cm (PMA)0.07f0.05f0.01fgh0.06gh0.05ef 五花草甸 15—30 cm (WHB)0.09e0.13e 0.05efg0.05h 0.09d沙棘灌木林 15—30 cm (HRB)0.07f0.02g0.05ef0.14a0.03h 柳樹(shù)灌木林 15—30 cm (SSB)0.13d0.02g 0.26b0.11bc 0.06e 山楊林 15—30 cm (PCB)0.05fg0.28c0.02fgh0.06h0.12c山楊白樺混交林 15—30 cm (PQB)0.38a0.17d0.04efgh 0.03ij 0.03gh 山楊白樺落葉松混交林 15—30 cm (PQLB)0.10e0.12e 0.01gh0.01j 0.01i落葉松云杉混交林 15—30 cm (LPB)0.05fg0.01gh 0.35a 0.08efg0.08d云杉林 15—30 cm (PMB)0.06fg0.12e0.01fgh0.07fgh 0.03h植被類型Vegetation types固氮弧菌屬Azoarcus硫針菌屬Sulfuritalea多形菌屬Polymorphum貪銅菌屬Cupriavidus芽孢桿菌屬Bacillus五花草甸 0—15 cm (WHA)0.08cd0.02efgh0.01gh0.03bcd 0.08a 沙棘灌木林 0—15 cm (HRA)0.17a0.18a 0.00h 0.03bc 0.02de 柳樹(shù)灌木林 0—15 cm (SSA)0.09bc 0.07c0.01gh0.01e0.00gh山楊林 0—15 cm (PCA)0.01h0.02fgh 0.02fg0.02de0.03cd 山楊白樺混交林 0—15 cm (PQA)0.03f0.03ef0.08a 0.02cde0.04b山楊白樺落葉松混交林 0—15 cm (PQLA)0.01h0.01hi0.05cd0.01e0.01f落葉松云杉混交林 0—15 cm (LPA)0.09b 0.03efg 0.02g 0.02bcde0.01fg 云杉林 0—15 cm (PMA)0.01h0.03e0.06b 0.03b0.00h 五花草甸 15—30 cm (WHB)0.09bc 0.06cd0.02fg0.06a0.02def沙棘灌木林 15—30 cm (HRB)0.04e0.11b0.03ef0.03bcd0.02ef柳樹(shù)灌木林 15—30 cm (SSB)0.10b0.10b0.01gh0.01de0.00h山楊林 15—30 cm (PCB)0.01gh0.02gh 0.04de0.02bcde0.04b 山楊白樺混交林 15—30 cm (PQB)0.02fg0.01hi 0.04de0.01e 0.02ef山楊白樺落葉松混交林 15—30 cm (PQLB)0.01h0.00i 0.02g 0.02bcde 0.01f落葉松云杉混交林 15—30 cm (LPB)0.07d0.05d0.02g0.02bcde0.00h 云杉林 15—30 cm (PMB)0.01gh 0.01hi0.06bc 0.07a0.04bc

同一列均值后不同字母表明在P≤0.05 水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)

在屬水平上,對(duì)不同植被類型土層間土壤反硝化菌群落組成相似度進(jìn)行聚類樹(shù)和熱圖分析可知(圖5)：16個(gè)樣本聚類為四大類群。其中,柳樹(shù)灌木林15—30 cm土層(SSB)與落葉松云杉林0—15 cm土層(LPA)、云杉林0—15 cm土層(PMA)與山楊白樺落葉松混交林0—15 cm土層(PQLA)土壤反硝化菌群落組成相似度較高；山楊白樺混交林15—30 cm土層(PQB)和山楊林0—15 cm土層(PCA),五花草甸0—15 cm土層(WHA)和山楊林15—30 cm土層(PCB)土壤反硝化菌群落組成較為相似；沙棘灌木林15—30 cm土層(HRB)和山楊白樺落葉松混交林15—30 cm土層(PQLB)土壤反硝化菌群落組成極為相似；而山楊白樺林0—15 cm土層(PQA)土壤反硝化菌群落組成與其他樣本相比差異較大。同時(shí),將相對(duì)豐度前50的屬聚類為5大類群,分別歸屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)等5個(gè)門。

圖5 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤中反硝化菌優(yōu)勢(shì)屬聚類熱圖Fig.5 Heat map and cluster of dominant denitrifiers at genus level in different riparian vegetation and soil layers of upper Wenyuhe watershed Nevskia 涅瓦河菌屬；Bacillus 芽孢桿菌屬；Psychrobacter 冷桿菌屬；Lactococcus 乳酸球菌屬；Arthrobacter 節(jié)桿菌屬；Pseudomonas 假單胞菌屬；Kineococcus 動(dòng)球菌屬；Conexibacter 康奈斯氏桿菌屬； Pseudonocardia 假諾卡氏菌屬；Microlunatus 小月菌屬；Sphingomonas 鞘脂單胞菌屬；Brevundimonas短波單胞菌屬；Micrococcus 微球菌屬；Acinetobacter 不動(dòng)桿菌屬；Propionibacterium 丙酸菌屬；Burkholderia 伯克氏菌屬； Rhodococcus 紅球菌屬；Microbacterium 微桿菌屬；Pedomicrobium 土微菌屬；Hyphomicrobium 生絲微菌屬；Afifella 假紅單胞桿菌屬；Geobacter 地桿菌屬；Candidatus.Rhabdochlamydia 棍衣原體屬；Nitrospira 硝化螺菌屬；Candidatus.Nitrosophaera 亞硝化螺菌屬；Opitutus豐佑菌屬；Couchioplanes 科氏游動(dòng)菌屬；Pilimelia 發(fā)仙菌屬；Devosia 德沃斯氏菌屬；Flavobacterium 黃桿菌屬；Mycobacterium 分枝桿菌屬；Planctomyces 浮霉?fàn)罹鷮伲籗teroidobacter 類固醇桿菌屬；Pirellula 小梨形菌屬；Lysobacter 溶桿菌屬；Rubrivivax 紅長(zhǎng)命菌屬；Gemmata 出牙菌屬；Mesorhizobium 中慢生根瘤菌屬；Phenylobacterium 苯基桿菌屬；Rhizobium 根瘤菌屬；Rhodoplanes 紅游動(dòng)菌屬 PQ：山楊白樺林Poplar birch forest；PM：云杉林 Picea forest ；WH：五花草甸 Multi-flower meadow；HR：沙棘灌木林 Hippophae shrub；PQL：山楊白樺落葉松林 Poplar birch and larix forest；PC：山楊林 Poplar forest； LP：落葉松云杉林 Larix and picea forest；SS：柳樹(shù)灌木林 Salix shrub；后加A表示0—15 cm土層；后加B表示15—30 cm土層

2.4 不同植被類型土壤反硝化菌群落特征與土壤理化因子相關(guān)性

對(duì)不同植被類型土壤反硝化酶活性、菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析(表4)表明:土壤有機(jī)碳(SOC)、速效磷(AP)和土壤含水量(SM)屬于關(guān)鍵性土壤環(huán)境因子；土壤反硝化酶活性(DEA)與土壤硝態(tài)氮呈顯著正相關(guān)(r=0.29,P≤0.05)；土壤反硝化菌群多樣性與銨態(tài)氮顯著正相關(guān)(r=0.36,P≤0.05),而與其余理化因子相關(guān)性不強(qiáng)。同時(shí),門水平上,土壤反硝化菌群落組成與土壤pH、土壤有機(jī)碳(SOC)和硝態(tài)氮呈顯著相關(guān)；變形桿菌門(Proteobacteria)與硝態(tài)氮呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.46,P≤0.01)；厚壁菌門(Firmicutes)與土壤pH呈顯著正相關(guān)(r=0.3,P≤0.05),而與土壤有機(jī)碳(SOC)(r=-0.32,P≤0.05)和硝態(tài)氮(r=-0.37,P≤0.01)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；放線菌門(Actinobacteria)與硝態(tài)氮呈極顯著正相關(guān)(r=0.47,P≤0.01)；綠彎菌門(Chloroflexi)與土壤有機(jī)碳(SOC)呈極顯著正相關(guān)(r=0.47,P≤0.01)。

表4 文峪河上游河岸土壤反硝化酶活性、菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群與土壤理化性質(zhì)相關(guān)系數(shù)

*：在P≤0.05水平上差異顯著,**：在P≤0.01水平上差異顯著(Tukey 檢驗(yàn)法)

圖6 文峪河上游河岸不同植被類型和土層土壤理化性質(zhì)、反硝化菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌屬的冗余分析Fig.6 RDA analysis of soil properties, denitrifiers diversiy and dominant taxas at genus level in different vegetation types and soil layers of upper Wenyuhe watershed 實(shí)心圓代表土壤理化因子；空心圓代表反硝化菌多樣性指數(shù)；三角形代表處理方式；菱形代表反硝化菌優(yōu)勢(shì)屬；SOC：土壤有機(jī)碳 Soil organic carbon；SM：土壤含水量 Soil moisture；AP：速效磷 Available phosphorus；TN：總氮Total nitrogen；DEA：土壤反硝化酶活性 Denitrifying enzyme acivity；Pseudomonas 假單胞菌屬；Azpspria 固氮螺菌屬；Azpsprillum 固氮螺菌屬；Rubrivivax 紅長(zhǎng)命菌屬；Rhodanobacter 羅河桿菌屬；Azoarcus 固氮弧菌屬；Sulfuritalea 硫針菌屬；Polymorphum 多形菌屬；Cupriavidus 貪銅菌屬；Bacillus 芽孢桿菌屬；Paracoccus副球菌屬；Magnetospirillum 趨磁螺菌屬； Thauera 陶厄氏菌屬；Dinoroseobacter迪諾氏桿菌屬；Herbaspirillum 草螺菌屬；Ralstonia 勞爾氏菌屬；Bordetella博德特氏菌屬；Ideonella 艾德昂菌屬

通過(guò)冗余分析可知(圖6)：土層深度與土壤總有機(jī)碳(SOC)、有效磷(AP)、土壤含水量(SM)、土壤總氮(TN)、土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,而與土壤pH值呈顯著正相關(guān)關(guān)系；不同植物植被類型之間的土壤總有機(jī)碳(TOC)、有效磷(AP)、土壤含水量(SM)等土壤理化因子有明顯的差異。紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)、固氮螺菌屬(Azospira)、硫針菌屬(Sulfuritalea)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、艾德昂菌屬(Ideonella)、草螺菌屬(Herbaspirillum)和固氮弧菌屬(Azoarcus)等屬受土壤硝態(tài)氮含量的影響較為顯著,且對(duì)土壤反硝化酶活性的貢獻(xiàn)值較大；貪銅菌屬(Cupriavidus)、副球菌屬(Paracoccus)、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、陶厄氏菌屬(Thauera)和迪諾氏桿菌屬(Dinoroseobacter)等屬受土層深度和土壤pH土壤值影響較為明顯,對(duì)土壤反硝化菌群多樣性貢獻(xiàn)值較大；Pseudogulbenkiania屬、博德特氏菌屬(Bordetella)、多形菌屬(Polymorphum)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)和Aromatoleum等屬受植被類型差異影響較大。

3 討論

目前,對(duì)文峪河上游河岸帶植物群落類型及生態(tài)適應(yīng)性[15]、演替分析與預(yù)測(cè)[4]以及群落環(huán)境梯度格局和演替過(guò)程[22]等方面研究較為深入,而對(duì)不同植被類型及土層土壤微生物多樣性及功能等研究甚少。本研究對(duì)文峪河上游河岸帶不同植被類型及土層土壤反硝化菌群多樣性及群落組成和土壤反硝化酶活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：文峪河上游河岸帶植被類型土壤反硝化菌群多樣性及群落組成和土壤反硝化酶活性,不僅受地表植被類型差異的影響,還受土壤土層間環(huán)境因子差異的影響,二者之間存在互作效應(yīng)。

土壤中反硝化菌群落數(shù)量及優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)對(duì)土壤反硝化作用產(chǎn)生重要影響[32],在反硝化作用中發(fā)揮重要功能的微生物多屬于異養(yǎng)、兼性厭氧細(xì)菌,如變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)等[33]。本研究結(jié)果表明：在文峪河上游河岸帶不同植被類型土壤中,共有5個(gè)反硝化菌優(yōu)勢(shì)種群,即變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)。其中變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度最高,且在不同植被類型土壤中反硝化細(xì)菌群落組成大致相似,這與戴雅婷等[34]和牛曉燕等[35]研究結(jié)論相一致。另外,厚壁菌門(Firmicutes)屬于五花草甸(WH)的優(yōu)勢(shì)菌群,放線菌門(Actinobacteria)屬于沙棘灌木林(HR)和柳樹(shù)灌木林(SSA)優(yōu)勢(shì)菌群,而浮霉菌門(Planctomycetes)僅在落葉松云杉混交林(LP)和云杉林(PM)土壤中被發(fā)現(xiàn),表明處于不同演替階段的植被類型土壤中存在各自獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群[36]。

對(duì)不同植被類型土壤理化性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)菌群相關(guān)性分析和冗余分析得出：在門水平上,土壤反硝化菌群落組成及相對(duì)豐度與土壤pH、土壤有機(jī)碳(SOC)和硝態(tài)氮含量相關(guān)性顯著,這說(shuō)明這三個(gè)土壤理化性質(zhì)影響影響土壤反硝化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群相對(duì)豐度含量和群落組成。在屬水平上,不同樣本土壤反硝化細(xì)菌群落組成差異顯著(表3),如在五花草甸(WH)土壤中芽孢桿菌屬(Bacillus)和貪銅菌屬(Cupriavidus)屬于明顯優(yōu)勢(shì)菌屬,而在云杉林(PM)土壤中勞爾氏菌屬(Ralstonia)、Aromatoleum屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)屬于明顯優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)不同優(yōu)勢(shì)菌屬在各樣本中相對(duì)豐度差異顯著,如假單孢菌屬(Pseudomonas)在山楊白樺混交林(PQ)15—30 cm土層中相對(duì)豐度明顯高于其他植被類型土層。這一研究結(jié)果充分表明,文峪河上游河岸帶不同植被類型土壤中反硝化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)及組成因植被類群的不同而呈現(xiàn)出明顯差異,這與柳春林等[37]研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

結(jié)合植被類型演替分析得出,文峪河上游河岸帶不同植被類型土壤反硝化菌群落結(jié)構(gòu)和功能具有顯著差異。土壤反硝化菌群多樣性指數(shù)變化大致呈“W”型,即在演替初期五花草甸(WH)、演替中期山楊白樺林(PQ)和演替頂級(jí)云杉林(PM)土壤中反硝化菌群多樣性較高；而土壤反硝化酶活性變化大致呈倒“V”型,即演替前中期沙棘灌木林(HR)和柳樹(shù)灌木林(SS)土壤中反硝化酶活性及反硝化功能最強(qiáng)；不同土層間土壤反硝化菌群落結(jié)構(gòu)和功能也存在顯著差異,即0—15 cm土層土壤反硝化菌群多樣性和反硝化酶活性顯著高于15—30 cm土層。

文峪河上游河岸帶植被類型土壤反硝化菌優(yōu)勢(shì)菌群主要隸屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)。不同植被類型不同土層土壤中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成差異顯著,如浮霉菌門(Planctomycetes)僅在落葉松云杉混交林(LP)和云杉林(PM)15—30 cm土層中分布,有明顯的特異性。表明植被類型和土層深度對(duì)土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成產(chǎn)生重要影響；而且土壤理化性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)菌群之間存在顯著相關(guān)性,其中土壤pH、土壤有機(jī)碳、土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量等環(huán)境因子是影響土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成的關(guān)鍵因子。