忽地笑ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(LaABCG5)的克隆和表達(dá)分析

劉彥彤， 王 蓉， 汪 仁

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京210014〕

忽地笑〔Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.〕隸屬于石蒜科(Amaryllidaceae)，是國內(nèi)常見的多年生草本植物，全株含有豐富的生物堿，包括水仙環(huán)素(narciclasine)、加蘭他敏(galanthamine)和石蒜堿(lycorine)等，其中石蒜堿和水仙環(huán)素被用于治療白血病，還作為抗腫瘤藥物[1-2]，而加蘭他敏是治療小兒麻痹癥、重癥肌無力和阿爾茨海默癥等疾病的關(guān)鍵藥物[3]。目前，加蘭他敏的主要獲取方式是從石蒜科植物中提取，但其含量僅在0.08%左右[3]。加蘭他敏的生物合成途徑最早由Barton等[4]提出，其中部分關(guān)鍵酶已經(jīng)明確。在合成途徑的上游，酪氨酸脫羧酶LaTYDC1將酪氨酸轉(zhuǎn)化為酪胺同3，4-二羥基苯甲醛合成異喹啉類生物堿的前體骨架降孤挺花啶[5]。Kilgore等[6-7]在黃水仙(NarcissuspseudonarcissusLinn.)的鱗莖中先后發(fā)現(xiàn)2個關(guān)鍵酶，即4-O-甲基轉(zhuǎn)移酶NpN4OMT和細(xì)胞色素P450 NpCYP96T1。Sun等[8]發(fā)現(xiàn)O-甲基轉(zhuǎn)移酶LaOMT1參與加蘭他敏的合成，且加蘭他敏在忽地笑的花、鱗莖和葉片中含量較高。通過分析加蘭他敏合成途徑中關(guān)鍵酶的組織定位發(fā)現(xiàn)，加蘭他敏主要在鱗莖中合成[6-7]，推測加蘭他敏在合成部位與儲存部位之間有特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與了加蘭他敏的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和長距離運(yùn)輸。

ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類跨膜蛋白，全稱為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過水解ATP釋放能量實(shí)現(xiàn)底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)，參與激素轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)分泌、有毒物質(zhì)集中和次生代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)等生理生化過程[10]，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)主要包含2個部分，分別是水解ATP的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD，nucleotide binding domain)和提供轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的含有多個α-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD，transmembrane domain)[11]。NBD位于膜的胞質(zhì)面，通過結(jié)合和水解ATP產(chǎn)生能量為轉(zhuǎn)運(yùn)底物提供動力。TMD則是利用NBD釋放的能量選擇底物并進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。兩者相輔相成共同實(shí)現(xiàn)了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[12]。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的不同，可以將大多數(shù)真核生物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為8個主要亞家族(A至H)，其中，ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ABC家族中體系最大的亞家族，ABCG亞家族具有結(jié)構(gòu)域類型為NBD-TMD的反向序列，與其他亞家族相區(qū)別[13-14]。

植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與多種次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，如日本黃連(CoptisjaponicaMakino)中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CjMDR1參與由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)小檗堿(berberine)的運(yùn)輸過程[15]，擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtABCG14參與細(xì)胞分裂素由胞內(nèi)向胞外的運(yùn)輸[16]，Physcomitrellapatens(Hedw.) Bruch et Schimp.中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PpABCG7參與蠟質(zhì)由胞內(nèi)向胞外的分泌過程[17]。本研究通過對茉莉酸甲酯(MeJA，methyl jasmonate)處理忽地笑比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，結(jié)合加蘭他敏在忽地笑體內(nèi)的分布和積累特性，報(bào)道了1個可能參與加蘭他敏轉(zhuǎn)運(yùn)和積累過程的ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，通過生物信息學(xué)分析、激光掃描共聚焦顯微鏡及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，確定了該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位，并對該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析，以期為石蒜科植物生物堿積累與轉(zhuǎn)運(yùn)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

忽地笑的花于2018年8月采自江蘇省中國科學(xué)院植物研究所藥用植物資源苗圃，根、鱗莖和葉片等于同年10月采自同一苗圃。所有樣品于-80 ℃保存。

實(shí)驗(yàn)使用的大腸桿菌感受態(tài)菌株TOP10和擬南芥原生質(zhì)體載體pAN580為本實(shí)驗(yàn)室保存； SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自美國Clontech公司；RNAiso試劑盒、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix、2×TaqMaster Mix (Dye Plus)和DL2000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自天津子涵生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中所有引物(表1)合成及核酸序列測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 供試引物序列及用途

Table 1 Sequences and usages of primers tested

引物 Primer序列(5′→3′) Sequence (5′→3′)用途 UsageLaABCG5-53CCATCTGCATAAGGTGGTGGTGGTGGAG5′-RACELaABCG5-101ATGGCAGTACCGGTTCCTTCGATCTTTC5′-RACELaABCG5-471GAAGGGTACGAAAACTAGTGCATTGGCG3′-RACELaABCG5-547AGAATGCGTCTAGACTCGGATTGAGTCC3′-RACELaABCG5-FCTTCTAAAATGAAGGAAATAGAAGGT克隆全長Cloning full lengthLaABCG5-RCCTCATATTAAAGAACTATACTTCCA克隆全長Cloning full lengthLaABCG5-RT-FCGCAGGTTAATGTCGTCGAG實(shí)時(shí)熒光定量PCR Real-time quantitative PCRLaABCG5-RT-RCTCCACCACCACCACCTTAT實(shí)時(shí)熒光定量PCR Real-time quantitative PCRLaTIP41FGCAACCATCCAAAGTTTAACTGCT實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參Real-time quantitative PCR internal referenceLaTIP41RAATGTGCAAGCAGGGCTAGTAA實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參Real-time quantitative PCR internal referenceLaABCG5-pAN580-FATGAATGATTACGCCAGCTTGCATG亞細(xì)胞定位Subcellular localizationLaABCG5-pAN580-RACCTATGACATAAGATGTCAAC亞細(xì)胞定位Subcellular localization

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆及序列比對

1.2.1.1 RNA提取 參照RNAiso試劑盒操作手冊，稱取約0.1 g植物組織，液氮速凍后均勻研磨，加入RNAiso reagent 1 mL，振蕩混勻后室溫靜置5 min，再加入三氯甲烷200 μL，振蕩混勻后室溫靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min；取上層水相，加入等體積異丙醇，輕柔混勻，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min；去上清液，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1離心10 min，去上清液；待乙醇揮發(fā)后，沉淀用RNase-free水溶解。

1.2.1.2 基因全長克隆 根據(jù)cDNA已知的基因片段755 bp設(shè)計(jì)RACE特異性引物(引物序列見表1)，進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE巢式PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系總體積為50.0 μL，包含5×SF Buffer 10.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、Phanta?Super-Fidelity DNA Polymere 1.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各2.0 μL、模板cDNA 1.0 μL及ddH2O 33.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶。回收的核酸片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株TOP10，陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.1.3 生物信息學(xué)分析 使用ORF finder(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析并確定忽地笑ABCG5基因的開放閱讀框；通過BLASTp(https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行氨基酸序列比對分析；利用MEGA 7.0中neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAMAN進(jìn)行同源序列比對；通過ExPASy(http：∥web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；通過SOPMA(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)在線分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；通過SWISS(http：∥swissmodel.expasy.org/interactive)模擬蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；通過TMHMM(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg)在線分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 基因相對表達(dá)量的比較

1.2.2.1 MeJA處理 將成熟度較高的忽地笑種子播種于滅菌蛭石中，置于光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度100 μmol·s-1·m-2、溫度22 ℃的光照培養(yǎng)箱中，用1/4 MS溶液澆灌，每隔3周更換1次蛭石，培養(yǎng)9個月。用一定量二甲基亞砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)助溶MeJA，用ddH2O配制終濃度100 μmol·L-1MeJA溶液。用100 μmol·L-1MeJA溶液噴施幼苗葉片，對照組用等體積DMSO水溶液噴施，分別在噴施后0、6、12、24和36 h取葉片。所有樣品于-80 ℃保存。

1.2.2.2 qRT-PCR分析 以忽地笑的LaTIP41基因作為內(nèi)參基因[18]。qRT-PCR反應(yīng)體系的總體積為20.0 μL，包含AceQ?qPCR SYBR?GreenMaster Mix 10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.5 μL、模板cDNA 1.0 μL及ddH2O 8.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[8]計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 亞細(xì)胞定位 首先利用在線軟件WoLF PSORT(https：∥wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測忽地笑ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位，然后用引物L(fēng)aABCG5-pAN580-F和LaABCG5-pAN580-R克隆獲得不含終止密碼子的LaABCG5片段，并將其構(gòu)建到pAN580載體中與綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽融合表達(dá)。根據(jù)Yoo等[19]的方法，將構(gòu)建的pAN580-LaABCG5-GFP與本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的膜定位標(biāo)記載體pAN580-PIP2A-mCherry同時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，避光孵育12～16 h，用Zeiss LSM780激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)在激發(fā)光波長488 nm、發(fā)射光波長505～530 nm 條件下進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Student-Newman-Keulsa方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 LaABCG5基因全長克隆

根據(jù)前期忽地笑比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中LaABCG5基因的部分序列信息設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RACE克隆技術(shù)，分別獲得已知片段5′端長度為1 052 bp和3′端長度為780 bp的DNA片段，再設(shè)計(jì)引物獲得長度為2 135 bp的序列。經(jīng)ORF finder分析LaABCG5基因的開放閱讀框，編碼區(qū)長度為1 896 bp(圖1)，編碼631個氨基酸。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹與同源序列比對分析

將LaABCG5的氨基酸序列與其他植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖2)表明：LaABCG5與擬南芥ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號為OAP10401.1)的同源性最高，然后與煙草(NicotianatabacumLinn.)ABCG10-like和ABCG23-like轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號分別為XP_016437027.1和XP_016433361.1)聚為一支。LaABCG5與擬南芥ABCG1和ABCG16轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號分別為OAP11713.1和OAP04470.1)的同源性也較高，與擬南芥其他ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也有一定程度的同源性。

圖1LaABCG5基因的PCR擴(kuò)增圖譜

Fig. 1 PCR amplification pattern ofLaABCG5gene

LaABCG5： 忽地笑ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ABCG5 transporter fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.； AtABCG5，AtABCG16，AtABCG1，AtABCG7，AtABCG14，AtABCG25，AtABCG12： 分別為擬南芥中ABCG5、ABCG16、ABCG1、ABCG7、ABCG14、ABCG25和ABCG12轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Respecting ABCG5， ABCG16， ABCG1， ABCG7， ABCG14， ABCG25， and ABCG12 transporters fromArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.， respectively； NtABCG10-like，NtABCG23-like，NtABCG35-like： 分別為煙草中ABCG10-like、ABCG23-like和ABCG35-like轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Respecting ABCG10-like， ABCG23-like， and ABCG35-like transporters fromNicotianatabacumLinn.， respectively； NpPDR1： 皺葉煙草PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PDR transporter fromNicotianaplumbaginifoliaViv.； CjMDR1： 日本黃連MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR transporter fromCoptisjaponicaMakino.

圖2 LaABCG5與其他植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 2 Phylogenetic tree of LaABCG5 and ABC transporters from other plants

采用BLASTp對LaABCG5與其他植物ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果(圖3)顯示：LaABCG5與海棗(PhoenixdactyliferaLinn.)和油棕(ElaeisguineensisJacq.)的ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號分別為XP_008810921.1和XP_010911492.2)的同源性分別為66.87%和66.57%，與番木瓜(CaricapapayaLinn.)和毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et Gray)的ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號分別為XP_021899883.1和XP_002309921.2)的同源性分別為62.91%和62.83%，與銀白楊(PopulusalbaLinn.)ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GenBank登錄號為TKR79274.1)的同源性為62.20%。

LaABCG5： 忽地笑ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.； EgABCG5： 油棕ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromElaeisguineensisJacq.； PtABCG5： 毛果楊A(yù)BCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromPopulustrichocarpaTorr. et Gray； PdABCG5： 海棗ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromPhoenixdactyliferaLinn.； CpABCG5： 番木瓜ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromCaricapapayaLinn.； PaABCG5： 銀白楊A(yù)BCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5 transporter fromPopulusalbaLinn.

圖3 LaABCG5與其他植物ABCG5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列的多重比對

Fig. 3 Alignment of amino acid sequences between LaABCG5 and ABCG5 transporters from other plants

2.3 LaABCG5的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

LaABCG5的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：LaABCG5的理論相對分子質(zhì)量為70 451，理論等電點(diǎn)為pI 8.37。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：LaABCG5的氨基酸序列中α-螺旋有308個氨基酸，所占比例為48.81%；延伸鏈有85個氨基酸，所占比例為13.47%；β-轉(zhuǎn)角有32個氨基酸，所占比例為5.07%；無規(guī)則卷曲有206個氨基酸，所占比例為32.65%。根據(jù)同源建模原理，PDB數(shù)據(jù)庫中已存在的ABCG2與LaABCG5的氨基酸序列的同源性達(dá)到31.36%，預(yù)測結(jié)果較好。使用ABCG2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板，對LaABCG5的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，結(jié)果見圖4。

蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果(圖5)顯示：膜內(nèi)氨基酸為1～385、442～461和519～524位，膜外氨基酸為409～418、482～495和548～612位，跨膜區(qū)域氨基酸為386～408、410～441、462～481、496～518、525～547和613～630位，表明LaABCG5是一個膜定位的蛋白，與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能吻合。

圖4 LaABCG5的三級結(jié)構(gòu)

Fig. 4 Tertiary structure of LaABCG5

圖5 LaABCG5的跨膜結(jié)構(gòu)域

Fig. 5 Transmembrane domain of LaABCG5

2.4 不同組織中LaABCG5基因的表達(dá)特性分析

結(jié)果(圖6)顯示：LaABCG5基因在忽地笑的根、鱗莖、葉片、花瓣和雌蕊中均有表達(dá)，其中，在葉片和雌蕊中相對表達(dá)量較高，顯著高于其他組織，而在鱗莖中相對表達(dá)量最低。說明LaABCG5基因在忽地笑中有組織表達(dá)特異性。

圖6 忽地笑不同組織中LaABCG5基因的相對表達(dá)量

Fig. 6 Relative expression ofLaABCG5gene from different tissues ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

2.5 MeJA處理后LaABCG5基因的表達(dá)特性分析

結(jié)果(圖7)顯示：100 μmol·L-1MeJA處理后6 h，LaABCG5基因相對表達(dá)量為對照(DMSO處理后6 h)的8.16倍，二者間存在顯著差異；100 μmol·L-1MeJA處理后12 h，LaABCG5基因的相對表達(dá)量均與對照(DMSO處理后12 h)無顯著差異。

圖7 MeJA處理后忽地笑葉片中LaABCG5基因的相對表達(dá)量

Fig. 7 Relative expression ofLaABCG5gene from leaf ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb. after MeJA treatment

2.6 LaABCG5的亞細(xì)胞定位分析

通過在線軟件WoLF PSORT預(yù)測分析，LaABCG5可能定位于細(xì)胞膜。為了進(jìn)一步明確LaABCG5的功能及亞細(xì)胞定位，構(gòu)建LaABCG5-GFP融合蛋白用于擬南芥原生質(zhì)體表達(dá)，并通過激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果(圖8)顯示：LaABCG5-GFP融合蛋白在細(xì)胞膜上有明顯的表達(dá)，且與共同轉(zhuǎn)化表達(dá)的定位于細(xì)胞膜的PIP2A-mCherry標(biāo)記蛋白有較好的重合。說明在亞細(xì)胞水平上，LaABCG5主要定位于細(xì)胞膜。

1： 表達(dá)LaABCG5-GFP(綠色)的原生質(zhì)體A protoplast expressing LaABCG5-GFP (green)； 2： 表達(dá)PIP2A-mCherry(紅色)的原生質(zhì)體A protoplast expressing PIP2A-mCherry (red)； 3： 原生質(zhì)體的葉綠素(藍(lán)色)Chlorophyll (blue) of the protoplast； 4： 1、2和3的疊加圖像Merged images of 1， 2， and 3； 5，6，7： 表達(dá)pAN580-GFP空載體的原生質(zhì)體A protoplast expressing pAN580-GFP empty vector.

圖8 LaABCG5的亞細(xì)胞定位

Fig. 8 Subcellular localization of LaABCG5

3 討 論

植物生長過程中會產(chǎn)生各種用于減少脅迫和自我保護(hù)且不參與生長和發(fā)育的物質(zhì)，稱為次生代謝產(chǎn)物，常見的植物次生代謝產(chǎn)物包括萜類、生物堿、芥子油和糖類等[20]。許多次生代謝產(chǎn)物有較高的藥用價(jià)值，如青蒿素、紫杉醇和小檗堿等[21]。次生代謝產(chǎn)物的合成和代謝長期以來一直備受關(guān)注，有關(guān)其轉(zhuǎn)運(yùn)和積累的運(yùn)輸過程也是研究人員的關(guān)注點(diǎn)之一。目前，植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為在次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中承擔(dān)了重要的角色[22-24]。Chen等[25]定義了第1個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家庭成員是參與細(xì)胞的藥物外排和促進(jìn)多藥耐藥機(jī)制形成的多耐性(MDR， multidrug resistance)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將其歸類于ABCB亞家族的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Shitan等[26]根據(jù)小檗堿主要特異性存儲于日本黃連的根中，在日本黃連根中發(fā)現(xiàn)了有轉(zhuǎn)運(yùn)小檗堿功能的CjMDR1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。已有研究結(jié)果顯示：加蘭他敏在忽地笑的花、鱗莖和葉片中含量較高[8]，且在MeJA處理下中國石蒜(LycorischinensisTraub)中加蘭他敏含量會顯著增加[27]。作者在MeJA處理忽地笑比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘到一個在MeJA處理下相對表達(dá)量升高的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，通過NCBI驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其與擬南芥中AtABCG5基因有較高的相似度，故命名為LaABCG5。LaABCG5基因全長1 896 bp，編碼631個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)構(gòu)顯示：LaABCG5含有6個跨膜區(qū)域。qRT-PCR結(jié)果顯示：LaABCG5基因在雌蕊和葉片中相對表達(dá)量較高，與加蘭他敏的積累組織[8]部分重合；在100 μmol·L-1MeJA處理后6 h，LaABCG5基因的相對表達(dá)量較對照顯著增加，與加蘭他敏含量在MeJA處理后的變化[27]也吻合。在亞細(xì)胞水平上，LaABCG5定位于細(xì)胞膜。這些證據(jù)都體現(xiàn)了該基因的組織特異性和表達(dá)模式與其承擔(dān)的功能有緊密聯(lián)系。

Shitan等[15，26]研究認(rèn)為，日本黃連中CjMDR1基因主要在其根狀莖、葉柄和花中表達(dá)，而CjABCB2基因則相對集中在根狀莖的木質(zhì)部表達(dá)，二者組織定位不同，但是在不同的組織部位同樣承擔(dān)著小檗堿從胞外向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)功能，CjMDR1可能在小檗堿含量不高的組織中起到積累小檗堿的作用，而CjABCB2則與小檗堿由根到根狀莖的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。韓小康等[28]的研究結(jié)果顯示：MeJA處理后6 h，忽地笑LaABCG3基因的表達(dá)水平升高了近4倍。LaABCG3基因主要集中在花瓣和種子中表達(dá)[28]，LaABCG5基因主要集中在雌蕊和葉片中表達(dá)，2個基因的組織定位有明顯的差異，推測在其承擔(dān)的功能上可能有較好的互補(bǔ)。王曉燕等[29]研究認(rèn)為，在忽地笑不同器官中加蘭他敏的亞細(xì)胞積累模式存在差異，這也暗示可能有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在加蘭他敏的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中協(xié)同合作，共同完成。本研究新發(fā)現(xiàn)的LaABCG5為忽地笑體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和積累機(jī)制提供了候選研究對象，但其具體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能仍待進(jìn)一步深入研究。