飼料中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素生物法降解研究進(jìn)展

彭 俊，勵(lì) 飛，劉 維，聶 勇

（湖南九鼎動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究院有限公司，長(zhǎng)沙 410007）

霉菌毒素主要是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于糧食、飼用原料、動(dòng)物飼料中，世界上每年約有25%谷物遭受各種霉菌污染，中國(guó)是霉菌毒素的重災(zāi)區(qū)。動(dòng)物攝入含霉菌毒素食品會(huì)引起的急性或慢性毒性，損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)霉菌毒素300～400種，其中與飼料密切相關(guān)的有黃曲霉毒素B1（AFB1）、單端孢霉烯族毒素（T2毒素、嘔吐毒素）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉素（OTA）、煙曲霉素等，影響范圍較廣[1]。如何有效的去除飼料和飼用日糧中的霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖至關(guān)重要。目前常用的去除霉菌毒素主要有微生物法、化學(xué)法和物理法，三種常用方法的措施、使用效果和優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)附表[2-10]。

附表 霉菌毒素脫毒方法和優(yōu)缺點(diǎn)比較

由附表可知，目前去除霉菌毒素的物理方法和化學(xué)方法都有明顯的弊端，而生物方法降解霉菌毒素具備效率高、安全、環(huán)保、成本低等優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的研究前景。本文主要介紹飼料及其原料中污染率和污染水平最高的兩種霉菌毒素（AFB1和DON）的特點(diǎn)、危害和致毒機(jī)制以及生物脫毒方面的研究進(jìn)展。

1 黃曲霉毒素B1

1.1 特點(diǎn)和致毒機(jī)制

黃曲霉毒素（AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其主體結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素[11-13]。目前經(jīng)鑒定出的黃曲霉毒素有20多種，主要分為B族、G族和M族等，毒性最強(qiáng)的是AFB1，早在1993年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署將AFB1定為一級(jí)致癌物[14-15]。AFB1（分子式為C17H12O6，相對(duì)分子質(zhì)量為312.06）分布廣泛、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，也是目前世界公認(rèn)為天然毒性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，一般的高溫和強(qiáng)酸條件難以將AFB1降解，只有在高溫268～269℃和低pH 1.0～3.0時(shí)才有少量降解[16]。但是，AFB1在堿性環(huán)境（pH 9.0～10.0）時(shí)會(huì)迅速被分解，此外AFB1不溶于水，但易溶于乙腈、丙酮、甲醇等[17]。目前，對(duì)AFB1的毒性研究主要包括致癌毒性、免疫毒性、生殖毒性和神經(jīng)毒性等，基本毒性單位是二呋喃環(huán)，其氧雜萘鄰?fù)慕Y(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的致畸和致癌作用[18]。AFB1經(jīng)細(xì)胞色素氧化酶的作用形成的代謝物AFB1-8,9環(huán)氧化合物及之后與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合是其發(fā)揮毒性作用的主要機(jī)制[19]。AFB1的主要靶器官是肝臟，動(dòng)物攝入AFB1后往往會(huì)引起發(fā)熱、食欲減退、厭食和腹瀉等，發(fā)展嚴(yán)重會(huì)引發(fā)急性肝炎、肝細(xì)胞壞死、肝充血等癥狀更嚴(yán)重會(huì)引發(fā)肝癌[20]。

1.2 生物吸附法脫除AFB1

采用生物吸附方式脫除AFB1與菌體本身的性質(zhì)有關(guān)，如微生物的細(xì)胞壁等。研究發(fā)現(xiàn)，真菌類和乳酸菌類對(duì)AFB1的吸附效果較好，Bovo等通過(guò)噴霧干燥和冷凍干燥處理滅活的鼠李糖乳桿菌，并用兩種干燥后的菌體分別吸附處理AFB1，研究發(fā)現(xiàn)噴霧干燥過(guò)程中因破壞了細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能而完全喪失AFB1的吸附能力，而在冷凍干燥過(guò)程中未破壞細(xì)胞壁，仍保持吸附AFB1的能力[21]。用于吸附AFB1的細(xì)菌中，乳酸菌是被研究最為廣泛的，主要是通過(guò)乳酸菌細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺為主要成分的肽聚糖對(duì)AFB1進(jìn)行物理吸附。此外，干酪乳桿菌對(duì)用于吸附壁AFB1的吸附率為49.2%，主要是其細(xì)胞壁產(chǎn)生胞壁酸的作用效果，開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri）同樣對(duì)AFB1有很強(qiáng)的吸附能力[22]。目前，研究酵母菌對(duì)AFB1的吸附少有報(bào)道，禹山林等從16株益生菌中篩選到一株吸附效果最佳的釀酒酵母對(duì)AFB1的吸附率是81.16%，試驗(yàn)表明了其是通過(guò)物理方式結(jié)合，可通過(guò)離心等方式去除，可廣泛應(yīng)用作飼料添加劑[23]。

1.3 生物降解法脫除AFB1

采用生物降解方式脫除AFB1主要是微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物或分泌的酶系破壞毒素的結(jié)構(gòu)，使毒素變?yōu)闊o(wú)毒或者低毒產(chǎn)物。孫糧等選出一株對(duì)AFB1降解率達(dá)到91.8%菌株（將AFB1降解為兩個(gè)未知物質(zhì)P1和P2），經(jīng)測(cè)序定種為地衣芽孢桿菌，并將該菌株的發(fā)酵液分為上清液和菌懸液分別用于降解AFB1，結(jié)果表明，降解AFB1的活性成分在上清液中，并初步驗(yàn)證該活性物質(zhì)是一種胞外酶[24]。王明清等分離到一株蠟樣芽孢桿菌，分析其胞外上清液、菌懸液和胞內(nèi)液對(duì)AFB1的降解率分別是91.7%、11.4%和7.6%，該試驗(yàn)也表明起作用活性物質(zhì)主要位于胞外液[25]。Wang等獲得了一種新型嗜熱復(fù)合菌系TADC7，由Geobacillus、Clostridium等細(xì)菌構(gòu)成，能在高溫下降解高濃度的AFB1，在120 h內(nèi)可將0.5 μg·mL-1的AFB1徹底降解，并表示TADC7的上清液起主要解毒作用，這種可徹底降解毒素且耐高溫和高濃度的復(fù)合菌系的研究和應(yīng)用前景廣闊[26]。目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌和真菌對(duì)AFB1有脫除作用，包括枯草芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、綠膿桿菌、假蜜環(huán)菌、黑曲霉等。研究表明，降解AFB1的活性物質(zhì)為微生物分泌的蛋白酶系，提取細(xì)菌和真菌的發(fā)酵粗提液降解AFB1也被廣泛研究。已知的降解AFB1的酶已從不同種類的微生物中被提取純化，并應(yīng)用于食品和飼料中，包括漆酶、AF氧化酶（AFO）、辣根過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶（MnP）、F420H2依賴性還原酶（FDR）等。

2 嘔吐毒素（DON）

2.1 特點(diǎn)和致毒機(jī)制

鐮孢霉毒素主要由鐮孢菌、頭孢霉、漆斑菌等產(chǎn)生，其中最重要、數(shù)量最多的毒素是單端孢霉烯類毒素（TS），該類毒素包含一百多種化合物，大致分為A類、B類等4個(gè)亞類。A類包括T-2毒素、HT-2毒素等，B類包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又名嘔吐毒素（DON）、雪腐鐮孢菌烯醇（NIV）和鐮孢菌烯酮-X等[27]。嘔吐毒素（分子式為C15H20O6，相對(duì)分子質(zhì)量為296.32）對(duì)谷物飼料的污染范圍和對(duì)動(dòng)物的健康危害程度居于單端孢霉烯類毒素之首，易溶于水、乙醇等極性溶劑，和AFB1類似的是：酸性環(huán)境、高溫很難破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，而在偏堿性條件下高溫可迅速破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)。DON化學(xué)式為3a,7a,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9稀-8酮，其12,13-環(huán)氧環(huán)為毒性基團(tuán)，可與核糖體結(jié)合，造成核糖體毒性壓力效應(yīng)，激活多種蛋白激酶，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，抑制蛋白合成并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)動(dòng)物的免疫功能、繁殖功能產(chǎn)生明顯的影響[28-29]。攝入低劑量的DON會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)造成骨髓組織的壞死和內(nèi)臟器官的出血、母畜不孕或流產(chǎn)以及死亡。

2.2 生物吸附法脫除嘔吐毒素

采用生物吸附法脫除DON，也與生物法吸附AFB1類似，主要是真菌類和乳酸菌類對(duì)嘔吐毒素的吸附效果較好。Shetty等研究酵母菌和乳酸菌對(duì)毒素吸附機(jī)制發(fā)現(xiàn)主要是這兩類微生物的細(xì)胞壁與毒素結(jié)合，吸附效果與菌株直接相關(guān)[30]。Repecˇkiene˙等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵地霉酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、馬克思克魯維酵母4種酵母對(duì)DON具有良好的吸附效果[31]。Niderkorn等研究29種乳酸菌和丙酸菌對(duì)DON的脫除效果，其中有6種有效果，脫除效果與細(xì)菌濃度和細(xì)菌種類有關(guān)，但同樣的細(xì)菌濃度，丙酸菌對(duì)DON的清除能力低于乳酸菌；活細(xì)菌與死細(xì)菌對(duì)DON的清除能力沒(méi)有顯著性差異[32]。Garda-Buffon等研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌米曲霉和米根霉可將DON吸收到菌絲體上，通過(guò)深層發(fā)酵降解DON，且降解速率在48 h后達(dá)到最大[33]。還有研究表明，羅伊乳桿菌的發(fā)酵液可抑制鐮刀菌孢子萌發(fā)從而減少DON的積累，鼠李屬乳酸菌株和費(fèi)氏丙酸桿菌株和DON混合可吸附64%～93%的DON[34-35]。

微生物吸收DON的原理主要與葡甘露聚糖在細(xì)胞壁上有關(guān)，目前從真菌細(xì)胞壁提取的葡甘露聚糖的解毒劑已廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)。微生物菌體細(xì)胞壁對(duì)DON吸附是可逆性的，DON的吸附作用與細(xì)菌的種類及濃度有關(guān)，因此需要進(jìn)一步改善吸附劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性[36-37]。

2.3 生物降解法脫除DON

采用生物降解法脫除DON，主要是通過(guò)微生物釋放胞外酶等作用于毒素分子，使其羥化、水解、去環(huán)氧化、脫乙酰和糖苷化而分解轉(zhuǎn)化為低毒化合物[38]。這些微生物主要包含德沃斯氏菌屬、諾卡氏菌屬、動(dòng)物腸道內(nèi)的厭氧細(xì)菌、芽孢桿菌和真菌等。Shima等從土壤中篩選到一株土壤桿菌屬根瘤菌（Agrobacterium Rhizobium）E3-39，該菌胞外提取液分泌的一種胞外酶，24 h可將培養(yǎng)基中200 μg·mL-1的DON代謝為3-keto-DON[39]。徐劍宏等從土壤和麥穗樣品中分離到一株德沃斯氏菌（Devosia insulae）DDS-1，該菌株對(duì)液體培養(yǎng)基中DON降解率＞95%，對(duì)小麥飼料中DON降解率達(dá)75.47%，研究發(fā)現(xiàn)，該菌株可產(chǎn)生一種氧化酶（3-acety-DON，該胞內(nèi)酶具有較好的溫度和酸堿穩(wěn)定性），將DON的結(jié)構(gòu)氧化為低毒化合物[40]。Khatibi等比較來(lái)自于7種鐮刀菌的3-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的特征，篩選出兩種最優(yōu)3-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因片段FgTRI101和FfTRRI201，并將其克隆到釀酒酵母中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可有效降低DON含量[41]。Fuchs等從牛瘤胃中分離到一株厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌BBSH797，該菌可將DON代謝成單一產(chǎn)物DOM-1（DOM-1的毒性僅為DON的1/55），已被商業(yè)開發(fā)為飼料脫毒劑[42-43]。He等使用高濃度DON作為選擇性壓力，從土壤樣品中分離到一株塔賓曲霉NJA-1，NJA-1菌株初酶液體外可轉(zhuǎn)化94.4%的DON，目前塔賓曲霉NJA-1已申請(qǐng)專利被開發(fā)為微生物脫毒制劑[44]。目前不同的微生物發(fā)酵的胞內(nèi)液和胞外液對(duì)DON降解研究較廣泛，但其中起作用的具體化合物的基礎(chǔ)研究卻少有報(bào)道。

3 總結(jié)與展望

目前利用微生物本身或其產(chǎn)生的脫毒酶對(duì)AFB1和DON的降解來(lái)消除或者降低其危害是目前解決該兩種毒素的有效途徑和研究熱點(diǎn)，主要針對(duì)降解AFB1和DON菌株的篩選、鑒定和脫毒條件和方式的優(yōu)化，但對(duì)脫毒物質(zhì)的分離、純化、降解產(chǎn)物的獲得以及降解產(chǎn)物的相關(guān)基因序列和其毒理學(xué)研究相對(duì)較少。AFB1、DON、ZEN等毒素在飼料及其原料中往往都不是單獨(dú)存在，只是不同毒素的含量存在差異，較多學(xué)者的研究是以單一毒素降解為目的進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)同時(shí)降解兩種或多種霉菌毒素的研究少有報(bào)道。

微生物能降解AFB1和DON，主要是微生物代謝產(chǎn)生的胞內(nèi)酶和胞外酶起作用，因此今后的研究可更深入研究降解AFB1、DON的胞內(nèi)酶或胞外酶的分離純化以及獲取關(guān)鍵酶的基因序列，應(yīng)用基因工程方法對(duì)基因進(jìn)行改造，使其關(guān)鍵酶活提高。再應(yīng)用基因工程方可將改造優(yōu)化后降解AFB1、DON等霉菌毒素的關(guān)鍵酶的目的基因轉(zhuǎn)入其菌體可吸附霉菌毒素的酵母菌或者細(xì)菌中，構(gòu)建雙重高效降解AFB1、DON等霉菌毒素且其菌體可吸附霉菌毒素的工程菌，并應(yīng)用到飼料及其原料的脫毒產(chǎn)業(yè)中。除構(gòu)建工程菌外，分別篩選高效脫除AFB1和DON的微生物，按照一定比例將兩種及以上微生物組合復(fù)配，并優(yōu)化復(fù)配比例，構(gòu)成復(fù)合微生物菌系使其可穩(wěn)定、高效脫除AFB1、DON等霉菌毒素。研究脫除飼料及其原料中霉菌毒素的工作意義重大，不僅可提高動(dòng)物飼料安全，而且可減少糧食浪費(fèi)，對(duì)我國(guó)動(dòng)物飼養(yǎng)行業(yè)和農(nóng)業(yè)的長(zhǎng)足穩(wěn)定發(fā)展影響深遠(yuǎn)。