“神寧藏香”對失眠大鼠的行為學(xué)及GABA能系統(tǒng)通路的影響＊

譚麗博，于佳慧，鄭驍洋，劉 燕，于 雪，戴 寧，張 蔚，仁青加，李 峰＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029；2. 西藏藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)藥研究所 拉薩 850000）

失眠是臨床常見病、多發(fā)病，主要表現(xiàn)為經(jīng)常不能獲得正常睡眠，或入睡困難，或睡眠時間不足，或睡眠不深，或睡后易醒，多夢，醒后疲乏，嚴(yán)重者徹夜不眠，影響工作效率或社會功能為特征的病癥。失眠主要由藥物、軀體疾病、心理因素以及環(huán)境改變等引起，長期睡眠障礙會導(dǎo)致精神思維異常，誘發(fā)多種身心疾病[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，失眠患者時常表現(xiàn)出一定的情緒障礙，特別是抑郁、焦慮、緊張和躁動不安等負(fù)性情緒[2]。據(jù)調(diào)查，我國人群中有45.5%存在不同程度的睡眠質(zhì)量問題[3]，失眠的患病率高達(dá)10%-48%[4]。長期失眠所帶來的負(fù)面影響遍及人們的工作和生活，嚴(yán)重者甚至?xí)饜盒砸馔馐鹿蔥5]。因此，失眠作為一種發(fā)病率逐年上升的身心疾病，隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快和工作壓力的加大，越來越嚴(yán)重的影響著患者的工作和生活質(zhì)量，它不僅僅是醫(yī)學(xué)問題，更是亟待解決的社會問題[6]。

目前臨床對于睡眠障礙的治法以重塑睡眠—覺醒節(jié)律為主[7]，治療藥物主要包括苯二氮卓類、非苯二氮卓類、三環(huán)類抗抑郁藥、褪黑素等[8]，但因部分藥物有成癮性、依賴性、宿醉感等不良反應(yīng)[9]，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制，甚至停用。心理療法和行為認(rèn)知療法（CBT-i）是國際上認(rèn)可度較高的失眠療法[10]，它以心理治療為核心，需要專業(yè)人士的指導(dǎo)，雖為世界上公認(rèn)的非藥物治療的最佳方案，但因目前尚缺乏訓(xùn)練有素的從業(yè)人員且診療費用較高，難以在國內(nèi)普及。

在失眠的治療方面，傳統(tǒng)藏醫(yī)積累了豐富的經(jīng)驗，形成了獨具特色的醫(yī)學(xué)理論和藥物療法[11]。值得一提的是藏香療法，除了具有防疫、避穢、預(yù)防流感等功效，在治療失眠方面也具有悠久的發(fā)展歷史，在西藏地區(qū)應(yīng)用廣泛。藏香療法使用獨特的鼻吸給藥途徑，使藥物成分直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，臨床應(yīng)用方便、藥效發(fā)揮快捷，可有效改善睡眠質(zhì)量，緩解疲勞，使人心曠神怡、神清氣爽[12]。由于藏香療法對于失眠的顯著療效、加之其價格低廉、攜帶方便等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為深受西藏人民青睞和喜愛的一種生活必需品，其顯著的應(yīng)用價值值得在全國推廣使用[11]。

因此，本研究基于藏香在失眠治療中的應(yīng)用，從行為學(xué)實驗角度探討“神寧藏香”對失眠大鼠不良情緒的干預(yù)作用，運用Western Blot技術(shù)從GABA 的合成代謝-傳導(dǎo)-轉(zhuǎn)運系統(tǒng)探討其對失眠大鼠下丘腦干預(yù)作用的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為臨床中使用“神寧藏香”治療失眠提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量190±10 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號為SCXK（京）2016-0006。嚴(yán)格按照實驗動物要求的飼養(yǎng)原則飼養(yǎng)于清潔級動物房，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物

Ⅰ陽性藥組（以下簡稱西藥組）：艾司唑侖片。

Ⅱ“神寧藏香”組（以下簡稱藏香組）：以松香、沉香、琥珀、藏紅花、藏寇、丁香、檀香、阿魏等藥制成藏香。

Ⅲ安神組（以下簡稱中藥組）：酸棗仁20 g，川芎9 g，知母15 g，茯苓18 g，生甘草9 g，清半夏10 g，梔子10 g，合歡皮15 g，夜交藤15 g。

艾司唑侖1 盒，購自中日友好醫(yī)院，常溫保存?zhèn)溆茫徊叵阌晌鞑夭蒯t(yī)學(xué)院及西藏自治區(qū)康松商貿(mào)有限公司制備，4℃保存；中藥安神方生藥購于北京同仁堂，并委托北京創(chuàng)立有限責(zé)任公司制備成浸膏，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器

DL-4-氯苯丙氨酸（PCPA）（aladdin，上海）；戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；BCA 蛋白含量檢測試劑盒（凱基生物，江蘇）；一抗GAPDH（Proteintech，美國），一抗GAD65（Proteintech，美國），一抗GABA-T（Proteintech，美 國），NKCCl（Proteintech，美 國），一 抗GAT-1（Proteintech，美國），兔二抗（Proteintech，美國），鼠二抗（Proteintech，美國）；全波長酶標(biāo)儀CPOCH（Bio-tek，美國）；蛋白電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（電源、電泳槽、電轉(zhuǎn)槽）（Bio-RAD，美國）；超靈敏多功能成像C600（Azure，美國）。曠場箱（眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，北京）懸尾實驗裝置（眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，北京），強(qiáng)迫游泳設(shè)備（眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，北京）。

2 實驗方法

2.1 復(fù)制失眠模型

SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天后，隨機(jī)分為空白對照組（以下簡稱正常組）（10 只）和失眠模型組（40 只）。模型組采用國際通用化學(xué)因素所致失眠模型制作方法，即“氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射法”復(fù)制失眠模型[13]，將PCPA 按400 mg/10 mL·kg-1用量，用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，于每日8:00-8:30對模型組大鼠進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射2 天。用戊巴比妥鈉翻正實驗評價模型成功與否，造模后大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、藏香組、中藥組。

2.2 實驗動物分組和給藥

使用SPSS 軟件生成隨機(jī)數(shù)字，將造模后的40 只大鼠，隨機(jī)分為以下4 組，每組10 只。模型組：連續(xù)7天生理鹽水灌胃；西藥組：連續(xù)7 天艾司唑侖灌胃；藏香組：放入10 m2獨立動物房飼養(yǎng)（遮光密閉），在上午8時、9時分別點燃1根半藏香，在11時點燃3根，燃香的空間距離大鼠≤5 m，熏燃時間為第1次和第2次30 min，第3 次60 min，連續(xù)給藥7 天；中藥組：連續(xù)7 天安神中藥浸膏灌胃。各組大鼠給藥量依據(jù)浸膏出膏率和大鼠給藥體表面積公式計算得出。正常組：連續(xù)7 天生理鹽水灌胃。

2.3 實驗及觀察指標(biāo)

2.3.1 一般狀態(tài)

觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤變化、進(jìn)食飲水量、體質(zhì)量變化及活動情況等。

2.3.2 戊巴比妥鈉翻正實驗

分別于第1 次腹腔注射和末次給藥36 h 后，依據(jù)藥量40 mg/Kg，對各組大鼠進(jìn)行腹腔注射戊巴比妥鈉，分別記錄各組大鼠腹腔注射時間、入睡時間和蘇醒時間，計算其睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間。

2.3.3 曠場實驗

于第6天給藥30 min后，大鼠在木箱中適應(yīng)1 min，用錄像設(shè)備進(jìn)行實驗過程錄制，記錄各組大鼠5 min內(nèi)中央格停留時間、中央格穿格次數(shù)、中心穿格數(shù)百分比、站立次數(shù)、修飾次數(shù)。兩次實驗之間，用低濃度乙醇溶液噴灑、清潔場箱內(nèi)壁及底面。

2.3.4 強(qiáng)迫游泳實驗

將大鼠依次放置在一個單獨的強(qiáng)迫游泳設(shè)備（高40 cm，直徑18 cm），其中水的高度30 cm（水溫25℃）。兩次游泳間期需要引導(dǎo)15 min預(yù)測試，24 h后進(jìn)行6 min的游泳測試。用錄像設(shè)備進(jìn)行實驗過程錄制，記錄各組大鼠6 min 測試內(nèi)大鼠游泳時間（s）、大鼠掙扎時間（s）、飄浮行為（不動）的持續(xù)時間。不動定義為順從的在水中漂浮于垂直位置，只需要小的運動以保持頭部在水面之上。

2.3.5 懸尾實驗

實驗在暗光，白噪聲條件下進(jìn)行，操作者將大鼠尾根部1/3用膠帶固定在懸尾儀器掛鉤上，使大鼠頭部朝下，用錄像設(shè)備進(jìn)行實驗過程錄制，觀察并記錄6 min內(nèi)各組大鼠的不動的時間（s）、掙扎次數(shù)（次）。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 取材

給藥結(jié)束后第2 天，各組大鼠進(jìn)行麻醉取材。腹主動脈取血、斷頭后，迅速剝離大鼠下丘腦，保存于-80℃冰箱冷凍待測，每組隨機(jī)選取6 只下丘腦進(jìn)行Western Blot檢測。

2.4.2 Western Blot

從-80℃冰箱取出待測大鼠下丘腦組織，加入ripa裂解液超聲勻漿，離心后提取上清，采用BCA 試劑盒、酶標(biāo)儀測定并計算各組組織總蛋白濃度，配平，使各樣本蛋白等量，蛋白樣品定量為50 μg。根據(jù)待測目的蛋白的分子量，選擇適宜分離膠濃度配膠，上樣并電泳，再電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉1.5 h 后，加入一抗GAD65（1:1000）、GABA-T（1:1000）、NKCC1（1:2000），GAT-1（1:1000）、GAPDH（1:50000），4℃孵育過夜，二抗溫孵育1.5 h，ECL 化學(xué)發(fā)光、曝光顯影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計描述使用以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示；統(tǒng)計分析先對各組數(shù)值進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若兩項都符合，則進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）；不符合則使用非參數(shù)檢驗，P＜0.05 表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較的結(jié)果柱形圖使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行繪制。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

與正常組相比，模型組大鼠毛發(fā)枯槁失去光澤，對外界刺激敏感、易激惹，進(jìn)食、飲水量明顯增加，但體質(zhì)量減輕。

3.2 戊巴比妥鈉翻正實驗

造模后，和正常組相比，模型組大鼠的睡眠潛伏期延長（P＜0.05），而模型組的睡眠持續(xù)時間明顯縮短（P＜0.01），在一定程度上表明成功復(fù)制失眠模型（圖1）。

給藥后，與正常組相比，模型組大鼠睡眠潛伏期顯著延長（P＜0.01）；各給藥組和模型組相比睡眠潛伏期有顯著性差異（P＜0.01）；并且，模型組高于西藥組和中藥組（P＜0.05，P＜0.05）；模型組雖與藏香組相比無差異，但是藏香組睡眠潛伏期有降低趨勢；西藥組高于中藥組，西藥組低于藏香組；中藥組低于藏香組。

給藥后，和正常組相比，模型組大鼠睡眠持續(xù)時間明顯縮短（P＜0.01）；和模型組相比，各給藥組睡眠持續(xù)時間有顯著性差異（P＜0.01），模型組低于西藥組、中藥組和藏香組（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；藏香組大鼠睡眠持續(xù)時間均高于中藥組和西藥組（圖2）。

3.3 曠場實驗

與模型組大鼠相比，正常組和各給藥組在曠場實驗的水平運動（中央格停留時間、中央格穿格次數(shù)、中心穿格數(shù)百分比）及垂直運動（站立次數(shù)、修飾次數(shù)）指標(biāo)上正常組均高于模型組（P＜0.05）（表1）。

圖1 戊巴比妥鈉翻正實驗結(jié)果圖

圖2 給藥后戊巴比妥鈉翻正實驗結(jié)果（±s，n=10）

表1 給藥后大鼠曠場實驗結(jié)果（±s，n=10）

表1 給藥后大鼠曠場實驗結(jié)果（±s，n=10）

注：與正常組比較，*表示P ＜0.05，**表示P ＜0.01；與模型對照組比較，△表示P ＜0.05，△△表示P ＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組藏香組中央格停留時間（s）38.36±18.941.77±1.46**9.74±1.46△△17.22±3.73△△5.43±0.75△△中央格穿格次數(shù)（次）3.43±2.371.57±0.78*3.29±1.25△1.86±1.062.71±1.38中心穿格數(shù)百分比（%）15.71±13.222.86±1.21*4.43±4.198.43±5.56△△6.71±6.87站立次數(shù)（次）18.71±13.996.57±4.35*16.29±5.64△△12.00±7.1115.57±5.68△△修飾次數(shù)（次）8.71±4.533.14±2.03*6.43±1.90△4.86±2.475.29±4.75

3.3.1 中央格停留時間

與正常組相比，模型組大鼠中央格停留時間有顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥組和藏香組均能顯著提高大鼠的中央格停留時間（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；中藥組大鼠在曠場中央格停留時間上高于西藥組和藏香組。

3.3.2 中央格穿格次數(shù)

與正常組相比，模型組大鼠中央格穿格次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；并且，與模型組相比，西藥組中央格穿格次數(shù)明顯增多（P＜0.05），中藥組和藏香組與模型組相比雖無差異（P＞0.05），但可看出有增高模型大鼠中央格穿格次數(shù)的趨勢；且西藥組高于中藥組和藏香組。

3.3.3 中心穿格數(shù)百分比

與正常組相比，模型組大鼠中心穿格數(shù)百分比顯著降低（P＜0.05），各給藥組與模型組兩兩比較后發(fā)現(xiàn)：中藥能顯著增加模型大鼠中心穿格數(shù)百分比（P＜0.01），西藥組、藏香組與模型組相比雖無差異（P＞0.05），但均有增高模型大鼠中心穿格數(shù)百分比的趨勢，且藏香組趨勢優(yōu)于西藥組。

圖3 懸尾實驗結(jié)果圖

圖4 大鼠強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果

3.3.4 站立次數(shù)

與正常組相比，模型組站立次數(shù)顯著降低（P＜0.05），各給藥組和模型組兩兩比較后發(fā)現(xiàn)：西藥組和藏香組均能顯著增加模型大鼠站立次數(shù)（P＜0.01，P＜0.01），且西藥組優(yōu)于藏香組；中藥組與模型組相比雖無差異（P＞0.05），但有明顯增加模型大鼠站立次數(shù)的趨勢。

3.3.5 修飾次數(shù)

與正常組相比，模型組修飾次數(shù)有顯著降低（P＜0.05），各給藥組和模型組兩兩比較后發(fā)現(xiàn)：西藥組能顯著增加模型大鼠修飾次數(shù)（P＜0.05）；中藥組、藏香組與模型組相比雖無差異（P＞0.05），但有明顯增加模型大鼠修飾次數(shù)的趨勢，且藏香組趨勢優(yōu)于中藥組。

3.4 懸尾實驗

與正常組大鼠相比，模型組大鼠不動時間顯著延長（P＜0.01），掙扎次數(shù)顯著降低（P＜0.05）。說明大鼠造模后出現(xiàn)明顯的負(fù)面情緒，表現(xiàn)為喜靜少動的絕望感。

與模型組相比，西藥組、中藥組、藏香組大鼠不動時間明顯縮短（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），且藏香組低于西藥組和中藥組，中藥組低于西藥組。

與模型組大鼠相比，各給藥組大鼠掙扎次數(shù)雖無差異（P＞0.05），但各給藥組有明顯增高模型大鼠掙扎次數(shù)的趨勢，且中藥組趨勢高于藏香組和西藥組，藏香組趨勢高于西藥組（圖3）。

3.5 強(qiáng)迫游泳實驗

3.5.1 漂浮時間

與正常組相比，模型組大鼠的漂浮時間顯著增加（P＜0.05）。給藥干預(yù)后，與模型組相比，中藥組、西藥組及藏香組大鼠的漂浮時間均非常顯著性減少（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），其中藏香組大鼠漂浮時間低于中藥組和西藥組（圖4）。

3.5.2 掙扎時間

與正常組相比，模型組大鼠的掙扎時間非常顯著降低（P＜0.01）。給藥干預(yù)后，與模型組相比，西藥組和中藥組大鼠的掙扎時間顯著增加（P＜0.05，P＜0.05），藏香組與模型組相比雖無明顯改變（P＞0.05），但有明顯增加模型大鼠掙扎時間的趨勢。

3.5.3 游泳時間

與正常組相比，模型組大鼠游泳時間明顯縮短（P＜0.01）。給藥干預(yù)后，西藥組、中藥組大鼠游泳時間比模型組顯著延長（P＜0.05，P＜0.01），藏香組與模型組相比雖無差異（P＞0.05），但有明顯增加模型大鼠游泳時間的趨勢。

3.6 失眠大鼠下丘腦中GABA-T、GAD65、NKCCl、GAT-1的蛋白表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示（表2、圖5）：

圖5 各組大鼠下丘腦GABA-T、GAD65、GAT-1、NKCCl的蛋白的表達(dá)

表2 各組大鼠下丘腦GABA-T、GAD-65、GAT-1、NKCCl結(jié)果（±s，n=6）

表2 各組大鼠下丘腦GABA-T、GAD-65、GAT-1、NKCCl結(jié)果（±s，n=6）

注：與正常組比較，*表示P ＜0.05，**表示P ＜0.01；與模型對照組比較，△表示P ＜0.05，△△表示P ＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組藏香組GABA-T 0.92±0.303.00±2.38**0.86±0.36△△1.08±0.47△1.43±0.90 GAD-651.69±0.970.76±0.24*1.75±0.93△1.32±0.41△1.13±0.43△GAT-12.30±1.360.74±0.27*2.42±2.40△△1.82±1.12△△1.65±1.37 NKCC10.93±0.071.40±0.53**1.13±0.42△1.12±0.43△1.15±0.52△

和正常組相比，模型組大鼠下丘腦GABA-T 蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；西藥組和中藥組表達(dá)比模型組顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），藏香組與模型組相比無差異（P＞0.05），但是有明顯下降趨勢。

和正常組相比，模型組大鼠下丘腦GAD-65 蛋白表達(dá)顯著性降低（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥組、藏香組大鼠下丘腦GAD-65 蛋白表達(dá)量均顯著性增高（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。

和正常組相比，模型組大鼠下丘腦GAT-1蛋白表達(dá)量顯著性降低（P＜0.05）。與模型組相比，西藥組和中藥組表達(dá)非常顯著上升（P＜0.01，P＜0.01），藏香組與模型組相比無差異（P＞0.05），但是有明顯上升趨勢。

和正常組相比，模型組大鼠下丘腦NKCC-1 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組、中藥組和藏香組大鼠下丘腦NKCC-1蛋白表達(dá)均顯著性降低（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。并且，藏香組NKCC-1蛋白表達(dá)高于西藥組，高于中藥組。

4 討論

隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增大，失眠的發(fā)病率日益增高，研發(fā)療效顯著、安全無副作用的抗失眠制劑勢在必行。藏香療法以其獨特的黏膜吸收途徑，直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有起效迅速，應(yīng)用方便等諸多優(yōu)勢，值得臨床上的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。

目前，對于失眠的機(jī)制研究結(jié)果顯示：失眠可能與GABA/GLU 系統(tǒng)有關(guān)[14]，而γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）是中樞系統(tǒng)中與失眠密切相關(guān)的神經(jīng)元[15，16]。因此本研究提出了GABA 系統(tǒng)功能失調(diào)是失眠維持性因素的假說，應(yīng)用行為學(xué)實驗從宏觀角度研究“神寧藏香”對失眠模型大鼠睡眠時長及失眠所導(dǎo)致的負(fù)性情緒的調(diào)控作用；應(yīng)用Western Blot分子生物學(xué)技術(shù)，探究失眠模型大鼠GABA 能系統(tǒng)通路中GABA 的合成代謝、傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運三個方面的神經(jīng)生物學(xué)療效機(jī)制。通過對“神寧藏香”進(jìn)行深入的研究，從而為開發(fā)和推廣治療失眠的新制劑提供依據(jù)。

4.1 研究對睡眠及情緒的影響

實驗結(jié)果表明，“神寧藏香”、中藥安神方及艾司唑侖均能通過縮短睡眠潛伏期，延長睡眠持續(xù)時間有效改善睡眠，且“神寧藏香”在縮短入睡時間、延長睡眠時間方面上有更顯著的優(yōu)勢。

有研究報道，普通人群中20%的失眠癥者伴有抑郁癥狀[17]，在對60 例原發(fā)性失眠癥的焦慮抑郁狀態(tài)調(diào)查分析的結(jié)果也同樣顯示[18]：原發(fā)性失眠癥患者與正常人相比存在不同程度的焦慮抑郁癥狀。強(qiáng)迫游泳實驗和懸尾實驗均能反映處于抑郁狀態(tài)的動物的抑郁程度[19-21]。實驗結(jié)果顯示，失眠模型大鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾實驗的不動時間均增加，提示其較快放棄逃脫希望，更多時間處于絕望狀態(tài)，反映出抑郁情緒。給藥干預(yù)后，“神寧藏香”、安神中藥方、西藥艾司唑侖均能縮短模型大鼠的漂浮時間和不動時間，緩解失眠造成的抑郁情緒，這與文獻(xiàn)中報道的抗抑郁藥動物實驗中的結(jié)果一致[22]，且“神寧藏香”對于改善失眠大鼠的抑郁狀態(tài)效果顯著。

曠場實驗是檢測動物情緒行為和在新異環(huán)境中的焦慮、緊張情緒，認(rèn)知、自發(fā)活動情況的經(jīng)典實驗。其中大鼠的焦慮狀態(tài)和認(rèn)知能力主要通過中央格停留時間表現(xiàn)[23]，大鼠的自發(fā)活動情況則通過中央格穿格次數(shù)、中心穿格數(shù)百分比和站立次數(shù)反映[24]。本次實驗中，失眠模型大鼠的曠場水平運動和垂直運動水平均顯著降低，提示由于失眠的影響，大鼠可能出現(xiàn)焦慮抑郁等負(fù)面情緒和認(rèn)知能力下降的情況，且自發(fā)活動明顯減少，出現(xiàn)了郁郁寡歡、喜靜少動等負(fù)性情緒。給藥干預(yù)后結(jié)果顯示，“神寧藏香”能有效延長模型大鼠中央格停留時間，增加站立次數(shù)，表明“神寧藏香”可有效緩解失眠大鼠的負(fù)面情緒的，同時在模型大鼠自發(fā)活動和空間探索能力方面有促進(jìn)作用，增強(qiáng)其對空間探索興趣。

4.2 研究對相關(guān)作用靶點的影響

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的大量GABA能神經(jīng)元與睡眠密切相關(guān)，而GABA 能系統(tǒng)通路中GABA 的合成代謝、傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)發(fā)生變化都會間接地影響GABA的含量以及生物功能，進(jìn)而影響睡眠[25]。Western Blot結(jié)果表明，失眠大鼠下丘腦中的GABA 能傳導(dǎo)功能出現(xiàn)異常，可能和GABA 的代謝、重攝取、受體亞基結(jié)合及其轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)：主要用于合成GABA 的GAD-65蛋白表達(dá)明顯增加，用于傳導(dǎo)的NKCC1蛋白表達(dá)明顯降低；與GABA 降解相關(guān)的GABA-T 降低，而GAT-1作為GABA 重攝取的主要轉(zhuǎn)運體，隨GABA 含量減少而降低蛋白表達(dá)。安神中藥、艾司唑侖等傳統(tǒng)失眠藥物的治療作用可能與該通路多靶點有關(guān)，通過促進(jìn)合成受體表達(dá)、減少GABA 的降解，降低轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，增加GABA 的重攝取，提高GABA 與受體的結(jié)合率，發(fā)揮GABA的神經(jīng)抑制作用，從而改善失眠。

另外，本實驗選取苯二氮?類藥物艾司唑侖作為陽性對照藥，作為傳統(tǒng)治療失眠的藥物，苯二氮卓類其作用靶點在抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA，即它與GABA相關(guān)受體結(jié)合而增多GABA 的釋放，從而抑制5-HT的產(chǎn)生和釋放[26]通過非選擇性拮抗γ-氨基丁酸苯二氮?（GABA-BZOA）復(fù)合體，起到了神經(jīng)的抑制性保護(hù)作用?！吧駥幉叵恪彼幮Щ镜韧陉栃詫φ账?，這一結(jié)果進(jìn)一步證實“神寧藏香”和陽性對照藥對于模型大鼠失眠的改善作用機(jī)制基本一致，其作用靶點主要是促進(jìn)GABA 合成蛋白GAD-65 的表達(dá)和降低轉(zhuǎn)運蛋白NKCC1 的表達(dá)，并有減少GABA 的降解蛋白GABA-T，增加其的重攝取蛋白GAT-1表達(dá)的趨勢。

4.3 優(yōu)勢與不足

香熏療法在唐宋時期發(fā)展到鼎盛階段，近代逐漸失傳。但在西藏地區(qū)，因其獨特的黏膜吸收途徑，直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)而起效迅速，應(yīng)用、攜帶方便等諸多優(yōu)勢一直沿用至今。藏醫(yī)理論認(rèn)為[27]，失眠因“隆”（相當(dāng)于氣或元氣）元紊亂、不足或邪氣阻滯所致。而藏香中常用藥物：松香、沉香、琥珀、藏寇、阿魏等數(shù)十種[28]，多為辛味藥物，辛“能行能散”，具有芳香解郁、行氣行血等作用；松香、沉香、丁香、琥珀均有降逆下行之效，有助于引陽入于陰[12]；藏紅花、藏寇、阿魏有有行氣活血，散郁開結(jié)的功效，有助于解心憂郁積，醒神益智；“神寧藏香”諸藥合用，一方面調(diào)節(jié)人體氣血津液的正常升降出入，氣血和而五臟安；另一方面氣血循常道而無邪氣阻滯，陽入于陰而寤寐如常?！吧駥幉叵恪边€可以明顯緩解各種原因引起的憂愁抑郁、思慮過度、精神紊亂等癥，實為快樂愉悅之香[11]。

本實驗是首次使用藏香治療失眠的動物實驗研究，主要研究藏香療法對于失眠大鼠的治療效果和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，以期進(jìn)一步拓寬藏藥的應(yīng)用和推廣。但本次研究也存在不足之處，實驗中主要采用在規(guī)定時間內(nèi)，整組大鼠在固定規(guī)格的房間內(nèi)集體聞嗅的方法進(jìn)行，可能不能很好地控制每只大鼠的具體給藥量，提示今后可對藏香的劑型進(jìn)行進(jìn)一步的改良，如研制藏香熏香劑揮發(fā)油制劑，并應(yīng)用單獨霧化吸入的方法，增加藏香有效成分的釋放，合理規(guī)劃鼻腔粘膜給藥方式的給藥量等，更好地控制和規(guī)范實驗操作方法，從而增加研究的規(guī)范性和可重復(fù)性。

5 結(jié)論

“神寧藏香”能夠有效地延長失眠大鼠的睡眠持續(xù)時間，改善失眠所產(chǎn)生的抑郁、緊張等負(fù)性情緒，增加其空間探索的興趣；并且其作用靶點主要是通過促進(jìn)失眠大鼠下丘腦中GABA 合成蛋白GAD-65 的表達(dá)和降低轉(zhuǎn)運蛋白NKCC1的表達(dá)而發(fā)揮治療作用，這也為臨床中推廣使用“神寧藏香”治療失眠提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。