高效毛細管電泳法測定熱毒寧注射液中陰陽離子和小分子有機酸成分的含量＊

葛 雯，楊 彪，于 洋，康經(jīng)武，李海波＊＊，王振中＊＊

（1. 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院 寧波 315100；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001；3. 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所生命有機化學(xué)國家重點實驗室 上海 200032；4. 暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所 廣州 510632）

熱毒寧注射液為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司在名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的原國家中藥二類新藥，由青蒿、金銀花和梔子3 味常用中藥組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，臨床上主要用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒、咳嗽、上呼吸道感染、手足口病以及流感引起的高熱不退等[1-4]，臨床應(yīng)用廣泛，效果顯著。且熱毒寧注射液自2005年上市后，先后被列入國家醫(yī)保目錄和中央藥品儲備品種。2010年，被列入衛(wèi)生部頒布的《手足口病診療指南（2010年版）》、《甲型H1N1 流感診療方案（2010年版）》以及《人感染H7N9 禽流感診療方案》[5]。2013年，熱毒寧注射液的核心專利技術(shù)獲得第十五屆中國專利獎金獎[6]。2014年，再次被列入《人感染H7N9 禽流感診療方案（2014年版）》[7]，并且被列入《登革熱診療指南（2014年第2版）》[8]。2017年，仍然被列入《人感染H7N9 禽流感診療方案（2017年第1版）》[9]。2019年，新型冠狀病毒爆發(fā)，熱毒寧注射液被國家衛(wèi)生健康委員會先后列入《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》和《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[10，11]。因此，完善熱毒寧注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重大的社會意義。

查閱文獻可知，熱毒寧注射液中化學(xué)成分復(fù)雜，除環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、倍半萜類和糖類等成分外，熱毒寧注射液中還包括陰陽離子和小分子有機酸等親水性成分[12-18]。為進一步提升熱毒寧注射液中結(jié)構(gòu)明確成分占總固含物的比例，從而完善熱毒寧注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本項目組前期研究先后建立了熱毒寧注射液的多成分定量分析方法及指紋圖譜[19-23]、總有機酸含量[24]、糖類成分[25]、細菌內(nèi)毒素[26]、有害元素鉛砷鎘汞銅[27]、高分子物質(zhì)[28]、聚山梨酯80[29]以及有機溶劑殘留[30]等相關(guān)含量控制方法。此外，注射劑的滲透壓是考察注射劑安全性的重要參數(shù)，而其滲透壓摩爾濃度與鈉（Na）、鈣（Ca）等離子濃度密切相關(guān)[31，32]。因此，為了完善熱毒寧注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究旨在于建立熱毒寧注射液中未報道的無機陰陽離子和有機酸的含量測定方法。

然而，由于中藥制劑成分的復(fù)雜性，對其中的親水性成分的定量分析常常比較困難。毛細管電泳（Capillary electrophoresis, CE）又稱高效毛細管電泳（High-performance capillary electrophoresis, HPCE）或毛細管電分離法（Capillary electro-separation method,CESM），是近十幾年來發(fā)展起來的一種高效分離分析技術(shù)。它具有分離模式多、量微、快速、溶劑消耗少、柱子便宜且易于清洗等優(yōu)點[33，34]，非常適合生產(chǎn)和保存過程中無機離子和小分子有機酸的含量測定[35，36]。因此，本研究建立了一種高效毛細管電分離法，同時對熱毒寧注射液中無機陰陽離子、小分子有機酸等親水性成分進行含量測定。該方法簡捷靈敏，可為熱毒寧注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器為P/ACE MDQ 毛細管電泳儀（Beckman Coulter,CA,USA），彈性石英毛細管柱（50 μm×60 cm，有效長度49.5 cm，美國Micropolymer Co.）；0.22 μm 針式濾器（上海安譜有限公司）。Sartorius PB-20 標(biāo)準(zhǔn)型pH 計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），天平（Satorius BS124S）。

氯化鈉（Sodium Chloride）（天津市博迪化工有限公司）；L-蘋果酸（L-Malic Acid）購自于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（Potassium Hydrogen Phthalate, KHP）和十六烷基三甲基氯化銨（Hexadecyl Trimethyl Aammonium Chloride, CTAC）均購自于阿拉丁試劑有限公司；氯化鉀（Potassium Chloride）（中國聯(lián)試化工試劑有限公司）；咪唑（Imidazole,Fluka）；α-羥基異丁酸（α-Hydroxyisobutyric acid, Fluka）；18-冠-6（18-crown-6, Aldrich）。甲醇（色譜純，Tedia，USA），乙腈（色譜純，Tedia，USA），超純水由Mill-Q 純水系統(tǒng)制得（Millipore, USA），其它試劑均為分析純，購于南京化學(xué)試劑有限公司。

熱毒寧注射液，批號分別為Z160706、Z160707、Z160708、Z160709、Z160710、Z160711、Z160712、Z160713、Z160714、Z160715，均為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱取氯化鈉和L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成無機陰離子與小分子有機酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，每種標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1000 μg·mL-1。

精確稱取氯化鈉和氯化鉀標(biāo)準(zhǔn)品，均配制成濃度為1000 μg·mL-1的無機陽離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液。

2.2 供試品溶液的配制

準(zhǔn)確取熱毒寧注射液成品10 個批次各1 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入50%甲醇近刻度，超聲處理30 min，放冷，用50%甲醇定容至刻度，12000 r·min-1離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.3 緩沖溶液的選擇

陰離子及小分子有機酸測定的背景電解質(zhì)：8%甲醇的20 mmol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀溶液，0.25 mmol·L-1十六烷基三甲基氯化銨為電滲流改性劑，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.8。

陽離子測定的背景電解質(zhì)：12 mmol·L-1咪唑，6 mmol·L-1α-羥基異丁酸為金屬離子絡(luò)合劑，用0.5 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)緩沖液pH值至4.0。

2.4 電泳條件

陰離子及小分子有機酸電泳條件：彈性石英毛細管柱（50 μm × 60 cm，有效長度49.5 cm），進樣壓力：0.6 psi×6 sec；電泳分離電壓：-12 kV；柱溫為25℃；檢測波長為232 nm。每天使用前依次用1 mol·L-1NaOH沖洗5 min，超純水沖洗5 min；兩次樣品分析之間用1 mol·L-1NaOH、超純水、緩沖液各沖洗5 min（圖1）。

陽離子電泳條件：彈性石英毛細管柱（50 μm×60 cm，有效長度49.5 cm），進樣壓力：0.6 psi × 8 sec；電泳分離電壓：15 kV；柱溫為25℃；檢測波長為214 nm。每天使用前依次用0.5 mol·L-1鹽酸沖洗4 min，去離子水沖洗4 min；兩次樣品分析之間用0.5 mol·L-1鹽酸、超純水、緩沖液各沖洗4 min（圖2）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）和供試品溶液（B）中無機陰離子及小分子有機酸的電泳譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）和供試品溶液（B）中無機陽離子的電泳譜圖

2.5 線性關(guān)系、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）的考察

將2種陽離子的儲備液用超純水配成質(zhì)量濃度為2.5、10、25、50、100、150、200、300 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將Cl-和L-蘋果酸的儲備液用超純水配成質(zhì)量濃度為5、10、20、40、60、100、200、250、500 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。不同濃度的溶液依次進樣，平行測定3 次。以各分析物的峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）進行線性回歸，得到線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限LOD（3 倍信噪比所對應(yīng)的濃度）、定量限LOQ（10 倍信噪比所對應(yīng)的濃度）及線性濃度范圍（表1）。可知，K+和Na+的檢出限分別為0.70 μg·mL-1、0.21 μg·mL-1，Cl-和L-蘋果酸的檢出限分別為2.10 μg·mL-1、3.10 μg·mL-1，表明該方法靈敏度高，滿足樣品測定要求。并且，上述4種分析物在各自的線性范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.9961-0.9993，說明線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系、檢測限和定量限考察結(jié)果

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2”項下的無機陽離子標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液和無機陰離子與小分子有機酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，分別配成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的無機陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的無機陰離子與小分子有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將2種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“2.4”項下的電泳分析條件，1日內(nèi)連續(xù)進樣6 次進行分析測定，以峰面積計算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation,RSD）作為日內(nèi)精密度；連續(xù)6日同一時間段分析測定，以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為日間精密度，兩者結(jié)合以考察方法的精密度。結(jié)果K+、Na+、Cl-、L-蘋果酸日內(nèi)精密度的RSD 值（n=6）分別為1.83%、1.53%、1.57%和1.79%，日間精密度的RSD 值（n= 6）分別為3.02%、10.44%、1.20% 和1.23%，說明該方法的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批次（批號Z160710）熱毒寧注射液，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.4”項下的電泳條件進行檢測，記錄其峰面積，計算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD考察方法的重復(fù)性。結(jié)果K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸的RSD 值（n= 6）分別為5.61%、3.03%、2.74%和3.00%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.8 穩(wěn)定性試驗

以批號為160710 的熱毒寧注射液成品作為方法學(xué)考察的樣品，按照“2.2”項下的方法配制供試品溶液，室溫下放置，按照“2.4”項下的電泳分析條件進行檢測，以同一樣品在同一天實驗，記錄其峰面積，計算得日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。以同一樣品連續(xù)6天進行平行實驗，記錄其峰面積，計算得日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 考察其無機陰陽離子及小分子有機酸的穩(wěn)定性。結(jié)果K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸的日內(nèi)RSD 值分別為1.46%、1.60%、1.80%、3.10%；日 間RSD 值 分 別 為1.75%、1.96%、0.17%、9.6%。說明無機陰陽離子及小分子有機酸在熱毒寧注射液中穩(wěn)定性較好。

2.9 加樣回收試驗

以已知含量的熱毒寧注射液成品（批號為160710）作為方法學(xué)考察的樣品，對達到定量限的無機陰陽離子和小分子有機酸進行加樣回收率的測定。準(zhǔn)確取熱毒寧注射液成品0.5 mL，以1:1 的比例加入相應(yīng)的K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸，按照“2.2”項下的方法平行配制6 份樣品溶液，再按照“2.4”項下的電泳分析條件進行檢測，計算加樣回收率，結(jié)果K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸的平均回收率分別為89.1%、106.8%、120.1%、120.7%，RSD值分別為1.57%、7.19%、4.1%、2.8%。

3 親水性成分的含量測定

取批號為Z160706、Z160707、Z160708、Z160709、Z160710、Z160711、Z160712、Z160713、Z160714、Z160715 的熱毒寧注射液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下的檢測條件測定各成分含量，結(jié)果10 批次熱毒寧注射液中K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸 的 平 均 含 量 分 別 為387.68、3941.25、1595.33、690.58 μg·mL-（1表2）。

表2 10批熱毒寧注射液中陽離子、陰離子及小分子有機酸含量（μg·mL-1）

4 討論

本項目組前期采用高效液相色譜法、紫外分光光度法、電感耦合等離子質(zhì)譜法等技術(shù)對熱毒寧注射液中綠原酸等18個結(jié)構(gòu)明確成分、總有機酸、糖類、細菌內(nèi)毒素、有害元素鉛砷鎘汞銅、高分子物質(zhì)、聚山梨酯80 以及有機溶劑殘留的含量進行測定，但未見對熱毒寧注射液中小分子有機酸及無機陰陽離子的相關(guān)報道。因此，為進一步提升熱毒寧注射液中結(jié)構(gòu)明確成分占總固含物的比例，完善熱毒寧注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本研究擬建立熱毒寧注射液中無機陰陽離子和小分子有機酸的含量測定方法。

高效液相色譜法可以用于測定小分子有機酸和無機陰離子的含量，但測定時需使用不同的色譜柱（小分子有機酸：反相色譜柱；無機陰離子：離子交換色譜柱）[37，38]，而毛細管電泳法只需改變電泳電壓和進樣壓力便可完成注射液中無機陰陽離子和小分子有機酸的含量測定，更加簡便、快捷。因此，本研究采用高效毛細管電泳法，同時對熱毒寧注射液中無機陰陽離子、小分子有機酸進行含量測定。

細內(nèi)徑的彈性石英毛細管的分離效果較好，且焦耳熱小，可施加較高的電壓；加大毛細管柱兩端電泳電壓能縮短分析時間，但加大電泳電壓的同時會使儀器的噪音增加；綜合考慮上述因素，最終確定使用內(nèi)徑為50 μm 的彈性石英毛細管柱，電泳電壓分別為-12 kV（陰離子及小分子有機酸）和15 kV（陽離子）。

預(yù)實驗中，本課題組共選擇4種無機陰離子（Br-、、6種無機陽離子Mg2+、Zn2+，其中與K+的分離通過添加1.4 mmol·L-118-冠-6 來實現(xiàn)）以及7種小分子有機酸（甲酸、酒石酸、L-蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸、乳酸）配置對照品，實驗結(jié)果顯示，熱毒寧注射液中除Na+、甲酸、L-蘋果酸、琥珀酸、醋酸、乳酸外的其他陰陽離子和小分子有機酸的含量均低于檢測限，且該注射液中、甲酸、琥珀酸、醋酸以及乳酸的含量均低于定量限。因此，最終確定K+，Na+，Cl-和L-蘋果酸為本次應(yīng)用高效毛細管電泳法測定熱毒寧注射液中陰陽離子和小分子有機酸的含量的指標(biāo)性成分。

本次實驗應(yīng)用毛細管電泳法對熱毒寧注射液中K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸的含量進行測定，各被測成分專屬性強，無雜質(zhì)干擾，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，在各成分的線性范圍內(nèi)，回歸方程的線性關(guān)系良好，儀器的精密度和方法的重復(fù)性均良好，且6 天內(nèi)無機陰陽離子及小分子有機酸在熱毒寧注射液中穩(wěn)定性較好。

本方法的方法學(xué)考察符合2015年版《中國藥典》的相關(guān)要求，且能快速、準(zhǔn)確、靈敏地同時測定熱毒寧注射液中K+、Na+、Cl-和L-蘋果酸的含量，其范圍分別為：300.25-505.00、3248.00-4520.50、1374.00-1736.25和637.00-786.00 μg·mL-1。為滿足《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》中“總固體中結(jié)構(gòu)明確成份的含量應(yīng)不少于60%”的標(biāo)準(zhǔn)，完善熱毒寧注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定了一定的基礎(chǔ)。