腎陽虛型慢性再障患者CD3+CD19-和CD3+CD25+T細胞與血小板的多重線性回歸分析＊

丁宇斌，唐旭東

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院 北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科 北京 100091）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭（bone marrow failure，BMF）綜合征，主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下，全血細胞減少和貧血、出血、感染。目前認為AA 的骨髓衰竭是自身反應(yīng)性細胞毒性T 淋巴細胞介導(dǎo)的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞的結(jié)果。以強力免疫抑制劑抗胸腺細胞球蛋白（ATG）或抗淋巴細胞球蛋白（ALG）聯(lián)合環(huán)孢素（CsA）為主的一線治療方案可獲得60-80%的有效率[1，2]，為此提供了有力的證據(jù)支持。慢性再生障礙性貧血（chronic aplastic anemia，CAA）較SAA病情相對穩(wěn)定，但CAA 患者血象恢復(fù)過程中與中性粒細胞（ANC）、血紅蛋白（HGB）相比，PLT的上升最為緩慢甚至可能終身未能恢復(fù)正常[3]，CAA 患者可因PLT 數(shù)量持續(xù)低下出現(xiàn)皮膚散在瘀點瘀斑，尿血便血，口腔粘膜、牙齦、舌面出血，或見視網(wǎng)膜火焰狀出血及棉絨狀滲出以及扇形較大面積視網(wǎng)膜前出血，嚴重影響患者生存質(zhì)量，口腔內(nèi)出血或眼底出血頻發(fā)常提示顱內(nèi)出血風(fēng)險增加，嚴重威脅患者生命，因此探索和分析CAA 患者PLT 數(shù)量的影響因素具有重要的臨床意義；且由于PLT 數(shù)量與CAA 患者的出血癥狀、出血風(fēng)險和生存質(zhì)量密切相關(guān)，通過預(yù)測PLT 數(shù)量在臨床治療后的轉(zhuǎn)歸有助于臨床醫(yī)師及時判斷和評估CAA 患者在臨床結(jié)局中的出血風(fēng)險及其對患者生存質(zhì)量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性和堅定患者的治療信心。

中醫(yī)根據(jù)AA 的臨床表現(xiàn)特點，將AA 的中醫(yī)學(xué)病名稱為“髓勞病”，“髓”為病位，“勞”代表病情與病性。中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科自20 世紀90年代提倡補腎生血法聯(lián)合ATG/ALG治療CAA，已經(jīng)取得了良好的療效，總有效率高達80%[4-8]。腎陽虛型是CAA 患者最為常見的中醫(yī)證型，此證型CAA 患者經(jīng)中西醫(yī)結(jié)合治療的總有效率最高[9，10]，本研究擬選取腎陽虛型CAA 患者，在充分發(fā)揮中醫(yī)藥辨證治療優(yōu)勢的同時，又能夠使研究成果最大可能地適用于CAA 患者群體。本研究收集2018年09月13日到2018月10月18日就診于西苑醫(yī)院血液科門診和住院部的腎陽虛型CAA患者外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T 細胞比例和PLT 共3 個參數(shù)，建立多重線性回歸模型分析其線性關(guān)系并探討腎陽虛型CAA 患者PLT數(shù)量在治療轉(zhuǎn)歸中的預(yù)測因素。

1 研究對象

病例來源于2018年9月13日至2018年10月18日就診于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科門診和住院部的腎陽虛型CAA患者共22例，其中男10例，女12例，年齡16-68歲，中位年齡43歲。

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準[11]

①血象：全血細胞減少，網(wǎng)織紅細胞減少，淋巴細胞比例增高。②骨髓穿刺：多部位（不同部位）骨髓增生減低或重度減低；小?？仗?，非造血細胞比例增高；巨核細胞明顯減少或缺如；紅系粒系均明顯減少。③骨髓活檢：全切片增生減低，造血組織減少，脂肪組織和/或非造血細胞增多，網(wǎng)硬蛋白不增加，無異常細胞。④除外PNH、hypo-MDS/AML等其他疾病。

1.1.2 中醫(yī)證候診斷標準[12]

腎陽虛證：乏力，心悸，氣短，活動后加重，面白唇淡，甲床蒼白，兼見畏寒喜暖，手足冷涼，腰酸，夜尿多，性欲減退，多無出血，或見大便稀溏，面浮肢腫，苔白質(zhì)淡，脈細無力。

1.2 納入標準

①符合西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)證候診斷標準；②年齡16-80 歲；③肝腎功能正常；④未參加其他臨床研究。

1.3 排除標準

①引起全血細胞減少的其他疾病，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、骨髓增生異常綜合征、急性造血功能停滯、骨髓纖維化；②先天性再生障礙性貧血；③合并嚴重心、腦、肝、腎疾病及精神病患者；④妊娠、哺乳期婦女。

2 研究方法

2.1 簽署知情同意書

告知檢查目的，保護隱私，患者表示知情同意并簽署知情同意書。

2.2 病例觀察指標

外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T細胞比例和PLT。T淋巴細胞免疫分型檢測方法：以肝素抗凝管（綠帽管）抽取空腹狀態(tài)患者靜脈血2 ml，以2-8℃冷藏運輸標本至天津協(xié)和華美醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司進行檢測，標本制備采用全血溶紅細胞法，溶血素為BC OptiLyse C No-Wash Lysing Solution，抗體標記采用九色法，細胞獲取數(shù)量10000個，抗體生產(chǎn)廠家BD，檢測儀器BC NAVIOS，結(jié)果分析采用CD45/SSC 設(shè)門法。HGB 的檢測方法：以EDTA抗凝管（紫帽管）抽取空腹狀態(tài)患者靜脈血2 mL，搖勻后用COULTER?LH 750 全自動血細胞分析儀進行檢測分析（美國貝克曼庫爾特公司），最終顯示血常規(guī)分類的結(jié)果，其中包括PLT。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，將外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞比例、CD3+CD25+T 細胞比例和PLT進行多重線性回歸分析。

3 結(jié)果

本研究采用多重線性回歸，納入外周血總T 細胞（CD3+CD19-）、活化T 細胞（CD3+CD25+）2 個自變量預(yù)測PLT。因?qū)W生化刪除殘差（SDR_1）有超過3 倍標準差的離群值1個，強杠桿點（LEV_1）＞0.5者1個，對這2條觀測值予以刪除。

已經(jīng)驗證研究觀測值之間相互獨立（Durbin-Watson 檢驗值為1.703）（表1）。本研究中兩個自變量相關(guān)系數(shù)為0.093 ＜0.7（表2），且所有容忍度值都大于0.1，且方差膨脹因子皆小于2，表明自變量不存在多重共線性（表3）。各觀測值Cook 距離皆小于1，即不存在強影響點，據(jù)此我們認為沒有需要處理的異常值。根據(jù)標準化殘差繪制的帶正態(tài)曲線的柱狀圖和P-P圖，判斷回歸殘差近似正態(tài)分布（圖1、圖2）。

表1 預(yù)測模型匯總

表2 多重共線性分析

圖1

圖2

表3 多重線性回歸結(jié)果

回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義（表4）F（2,17）=19.479（P＜0.001），R2= 0.696，調(diào)整R2= 0.660。納入模型的2 個自變量對PLT 的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見表2。將表3 中系數(shù)代入回歸方程，得：PLT = 391.585 - 5.104 × (CD3+CD19-) + 23.851 ×(CD3+CD25+)。

表4 ANOVAa

由模型結(jié)果知，CD3+CD19-T 細胞占淋巴細胞的比 例 每 增 加1%，PLT 平 均 降 低5.104 × 109·L-1，CD3+CD25+T 細胞占淋巴細胞的比例每增加1%，PLT平均升高23.851×109·L-1。

4 討論

目前認為AA 的骨髓衰竭是自身反應(yīng)性細胞毒性T 淋巴細胞介導(dǎo)的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞的結(jié)果。AA 大致可以分為以異常免疫為主和以骨髓衰竭為主兩個階段，其中急性或重型AA（SAA）以異常免疫為主，此階段AA 中醫(yī)辨證多屬腎陰虛型；CAA 以骨髓衰竭為主，此階段患者辨證多屬腎陽虛型[13]。既往研究[14-16]認為細胞毒T 淋巴細胞(CTL) 的異?；罨驮鲋呈且餉A 造血功能衰竭的重要原因，所分泌的造血抑制因子如IFN-γ、TNF-α最終可導(dǎo)致造血功能衰竭，可能是AA的免疫病理學(xué)機制基礎(chǔ)。T細胞亞群的表達、多種細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-10 和TGF-β）的水平皆與中醫(yī)辨證分型密切相關(guān)，在腎陰虛型、腎陽虛型和腎陰陽兩虛型AA 患者中呈現(xiàn)不同表現(xiàn)[14,17]。

近年研究[18-20]發(fā)現(xiàn)活化標記物CD25 不僅表達在活化的T細胞上，也表達于Treg細胞；Treg細胞表面標記物為CD4+CD25highCD127-/low，能夠在大于90% 的CD4+CD25highCD127-/lowTreg 細胞中檢測到細胞核蛋白Foxp3 的表達，且因Foxp3 能夠抑制CD127 的啟動子，CD127 與Foxp3 表達呈負相關(guān)，F(xiàn)oxp3highTreg 細胞呈現(xiàn)CD127low。Treg 細胞能夠進行免疫負向調(diào)控從而維持機體的免疫平衡，Treg 細胞數(shù)量的降低或功能減弱會導(dǎo)致自身免疫耐受損傷、免疫功能紊亂并最終導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。T細胞亞群在SAA 治療中的療效預(yù)測價值研究表明[21]，CD3+CD25+T 細胞比例能夠作為SAA 療效的預(yù)測性指標，其升高提示療效較佳；CD3+CD25+T細胞比例大于3%提示預(yù)后較好和生存期較長。

CAA較SAA病情相對穩(wěn)定，但CAA患者血象恢復(fù)過程中PLT 的上升最為緩慢，部分CAA 患者PLT 甚至終身未能復(fù)常[3]，若PLT 數(shù)量持續(xù)低下可出現(xiàn)尿血便血、皮膚粘膜或牙齦舌面出血、視網(wǎng)膜出血等多種出血表現(xiàn)并將嚴重影響患者生存質(zhì)量，口腔內(nèi)出血或眼底出血頻發(fā)常提示顱內(nèi)出血風(fēng)險增加，因此探索和分析CAA 患者PLT 數(shù)量的影響因素具有重要的臨床意義；由于PLT 數(shù)量與CAA 患者的出血癥狀和生存質(zhì)量密切相關(guān)，通過預(yù)測PLT 數(shù)量在臨床治療后的轉(zhuǎn)歸有助于臨床醫(yī)師及時判斷和評估CAA 患者在臨床結(jié)局中的出血風(fēng)險及其對患者生存質(zhì)量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性。腎陽虛型是CAA 患者最為常見的中醫(yī)證型，此證型CAA 患者經(jīng)中西醫(yī)結(jié)合治療的總有效率最高[9，10]，因此本研究中納入的病例均為腎陽虛型CAA 患者，在充分發(fā)揮中醫(yī)藥辨證論治優(yōu)勢的同時，又能夠使研究成果具有更強的普適性。本研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛型CAA 患者的外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例每增加1%，PLT 平均降低5.104×109·L-1，提示T 淋巴細胞與PLT 之間呈負相關(guān)，證實了T 淋巴細胞介導(dǎo)的造血干/祖細胞（HSPC）免疫破壞在CAA 病理機制中的重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)CD3+CD25+T 細胞占淋巴細胞的比例每增加1%，PLT 平均升高23.851 × 109·L-1，與CD3+CD25+T細胞比例作為SAA 療效的有利預(yù)測性指標的研究結(jié)論相一致[21]。本研究表明模型中引入的變量能夠解釋腎陽虛型CAA 患者PLT 數(shù)量變化的66%（調(diào)整R2=0.660），能夠在臨床上作為腎陽虛型CAA 患者PLT 數(shù)量變化的有效預(yù)測指標，即通過腎陽虛型CAA 患者的外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例和CD3+CD25+T 細胞的比例能夠估計和預(yù)測患者在未來的臨床轉(zhuǎn)歸中PLT 的值及其變化趨勢。譬如在外周血淋巴細胞中CD3+CD19-T 細胞的比例降低和CD3+CD25+T 細胞的比例增加將在很大程度上預(yù)示著該患未來PLT 有升高的趨勢。根據(jù)PLT 的轉(zhuǎn)歸趨勢，臨床醫(yī)師能夠及時判斷和評估CAA 患者在臨床結(jié)局中的出血風(fēng)險及出血癥狀對患者生存質(zhì)量的影響，有利于提高CAA 患者在臨床治療中的依從性和堅定患者治療信心。本研究納入病例數(shù)僅22例，尚需進一步擴大研究對象樣本數(shù)量以提供堅實可靠的數(shù)據(jù)支持和完善臨床研究；腎陽虛型CAA 患者PLT 數(shù)量的其他潛在影響因素也有待進一步研究。