基于文獻(xiàn)的冠心病血瘀證相關(guān)蛋白互作模塊及miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建＊

諶子諾，王 階，陳恒文，劉詠梅，何浩強(qiáng)，陳 光，楊 光，周思遠(yuǎn)

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 北京 100029；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

冠心病是我國(guó)發(fā)病率較高的心血管疾病，血瘀證是冠心病中最常見(jiàn)的證候，歷年來(lái)一直被科學(xué)家們關(guān)注研究。在多組學(xué)層面冠心病血瘀證研究已經(jīng)取得了一些實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，學(xué)者們通過(guò)基因芯片、高通量測(cè)序等多種技術(shù)手段找到了許多差異基因表達(dá)譜，并予以生物信息學(xué)分析。但目前仍未完全明確冠心病血瘀證的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)研究間彼此獨(dú)立，對(duì)于不同研究得到的差異結(jié)果，未建立冠心病血瘀證基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整合分析。本研究通過(guò)查找冠心病血瘀證基因?qū)W研究相關(guān)文獻(xiàn)，整合冠心病血瘀證差異基因中mRNA 和miRNA 數(shù)據(jù)，構(gòu)建冠心病血瘀證關(guān)鍵蛋白的互相作用網(wǎng)絡(luò)。針對(duì)冠心病血瘀證核心mRNA，挖掘其生物功能與涉及的通路。繼而根據(jù)基因間調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并定位其中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，分析核心基因的信號(hào)通路與生理病理機(jī)制，以期為研究冠心病血瘀證的發(fā)生發(fā)展過(guò)程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

從中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、維普數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、Embase、PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索自數(shù)據(jù)庫(kù)收錄日期-2019年12月冠心病血瘀證的研究。中文搜索“（冠心病OR 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。〢ND 血瘀AND 基因”，英文搜索“coronary heart disease AND blood stasis AND gene”。

①中國(guó)知網(wǎng)檢索式：SU=（′冠心病′+′冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病′）*′血瘀′*′基因′；②萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)檢索式：題名或關(guān)鍵詞=（（"冠心病"+"冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病"）*"血瘀"*"基因"）；③維普數(shù)據(jù)庫(kù)檢索式：M=（冠心病OR 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。〢ND 血瘀AND 基因；④中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)：摘要=（冠心病OR 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。〢ND 血瘀AND基因；⑤Embase 檢索式：′coronary heart disease′:ti,ab,kw AND′blood stasis′:ti,ab,kw AND gene:ti,ab,kw；⑥PubMed檢索式：（coronary heart disease[Title/Abstract]AND blood stasis[Title/Abstract]）AND gene[Title/Abstract]。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除

1.2.1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

①納入文獻(xiàn)形式包括期刊論著、學(xué)位論文、會(huì)議論文及會(huì)議摘要。②納入文獻(xiàn)需能提供足夠的所需研究信息。③納入研究疾病為冠心病，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)v年醫(yī)學(xué)界發(fā)布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)或指南，如1979年WHO缺血性心肌病“心絞痛”“心肌梗死”的診斷標(biāo)準(zhǔn)、2007年ACC/AHA/ACP-ASIM《慢性穩(wěn)定性心絞痛診療指南》、2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《冠心病診斷和治療指南》等。④納入研究證型為血瘀證，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)v年中醫(yī)界發(fā)布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)、指南或教材，如1988年王階、陳可冀制定《血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)量表》、1995年《中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》、1997年《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨診療術(shù)語(yǔ)·證候部分》、2002年《中醫(yī)心病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)與用藥規(guī)范》、陳可冀主編《實(shí)用血瘀證學(xué)》等。⑤納入研究樣本種族僅限人類。⑥納入研究技術(shù)為基因芯片、測(cè)序技術(shù)、qRT-PCR、免疫組化等檢測(cè)技術(shù)。⑦納入研究指標(biāo)為mRNA、miRNA、血清蛋白等。

1.2.2 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

①排除文獻(xiàn)形式包括綜述、個(gè)案報(bào)道、回信書(shū)籍及社論等。②排除文獻(xiàn)包括無(wú)法獲取摘要或全文信息的文獻(xiàn)。③排除研究?jī)?nèi)容重復(fù)的文獻(xiàn)；不同數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源，作者、題目及出版年相同的文獻(xiàn)按1篇統(tǒng)計(jì)。④排除研究類型為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)。⑤排除研究疾病非冠心病，證型非血瘀證的文獻(xiàn)。

1.3 資料提取與數(shù)據(jù)統(tǒng)一

將文獻(xiàn)資料的基本信息與基因數(shù)據(jù)運(yùn)用EXCEL2010 軟件進(jìn)行梳理匯總，并在GeneCards 人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、NCBI gene 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、HGNC人類基因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.genenames.org/）、miRBase（http://www.mirbase.org/）4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，將文獻(xiàn)中提取的差異基因統(tǒng)一整理為Gene symbol形式。

1.4 冠心病血瘀證關(guān)鍵蛋白互作模塊構(gòu)建

利用InWeb_IM、OmniPath、BioGrid 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)所有冠心病血瘀證相關(guān)的差異mRNA 數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，其中密集連接的網(wǎng)絡(luò)組件被分子復(fù)雜檢測(cè)（MCODE）算法所識(shí)別，提取成為關(guān)鍵蛋白互作模塊。運(yùn)用整合DrugBank、UniProt、GO、KEGG 等多個(gè)權(quán)威的數(shù)據(jù)資源Metascape 在線工具（http://metascape.org）完成冠心病血瘀證相關(guān)上調(diào)mRNA 和下調(diào)mRNA 的通路富集和生物過(guò)程注釋。

1.5 冠心病血瘀證相關(guān)miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將mRNA、miRNA 統(tǒng)一整理為Gene symbol 形式后，利用涵蓋高通量CLIP-Seq 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（CLIP-Seq 和HITS-CLIP）和降解組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（Degradome sequencing）的starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋micorRNA 的靶標(biāo)，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相互驗(yàn)證后將靶標(biāo)對(duì)導(dǎo)入OmicShare Tools（www.omicshare.com/tools）在線工具繪圖，構(gòu)建冠心病血瘀證核心miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合Webgestalt（http://www.webgestalt.org/）在線工具，針對(duì)miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)mRNA 運(yùn)用ORA 富集方法，選擇KEGG 通路和Gene Ontology（GO）中生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行可視化分析。

2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

本次中外6 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索出文獻(xiàn)458 篇，其中知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)240 篇，萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)111 篇，維普數(shù)據(jù)庫(kù)59篇，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)10篇，PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)16篇，EMBASE 數(shù)據(jù)庫(kù)22 篇。以上去除重復(fù)文獻(xiàn)后為274篇。通過(guò)閱讀題目與摘要進(jìn)行初步篩選140篇，經(jīng)下載閱讀全文進(jìn)一步篩選，依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)納入病種為冠心?。ê€(wěn)定型或不穩(wěn)定型心絞痛、冠心病PCI 術(shù)后），納入證型為血瘀證（不含兼雜證候），最后符合納入指標(biāo)的文獻(xiàn)15篇（表1）。

表1 納入文獻(xiàn)的研究基本信息

納入的15項(xiàng)研究中，排除數(shù)據(jù)重復(fù)的基因和依據(jù)文獻(xiàn)無(wú)法判斷基因趨向的mRNA，共獲得冠心病血瘀證相關(guān)66 個(gè)上調(diào)mRNA、47 個(gè)下調(diào)mRNA、55 個(gè)上調(diào)miRNA、46個(gè)下調(diào)miRNA（表2）。

3 構(gòu)建關(guān)鍵蛋白互作模塊

針對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)提取到冠心病血瘀證相關(guān)的mRNA，在Metascape 人類基因組中鏈接得94 個(gè)基因，使用InWeb_IM、BioGrid、OmniPath 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用映射，生成的蛋白質(zhì)子集與提交的基因列表需有至少一個(gè)mRNA 形成相互作用，將蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)與Reactome Gene Sets、Canonical Pathway、GO Biological Processes、KEGG Pathway 多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合，形成冠心病血瘀證差異基因相關(guān)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)功能注釋圖（圖1）。

不同的顏色代表不同的類，每個(gè)點(diǎn)代表互作網(wǎng)絡(luò)的連接蛋白質(zhì)，根據(jù)富集程度來(lái)著色，顏色越深表示該類通路富集到的基因數(shù)目越多。取2類具有代表性的MCODE 子模塊抽象出來(lái)分析（圖2），將MCODE 子模塊中蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)通路中按p值劃分得3 個(gè)最佳項(xiàng)，針對(duì)該通路進(jìn)行功能描述和注釋（表3）。

模塊1（圖標(biāo)紅色）包含2 條Canonical 信號(hào)通路和1 條GO 生物過(guò)程，其中IL6、EGR1、TP53、JUN、FOS 為涉及冠心病血瘀證的5 個(gè)核心蛋白。模塊2（圖標(biāo)藍(lán)色）包含2 個(gè)KEGG 信號(hào)通路和1 條GO 生物過(guò)程，彼此間交集得到4 個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)CTSL、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB5。

使用Metascape 分別分析上調(diào)和下調(diào)的冠心病血瘀證差異mRNA，以Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、DisGeNET、PaGenBase、CORUM、GO Biological Processes、KEGG Pathway、TRRUST 為數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源，通路富集得到具有代表性的通路（表4）。

4 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

依據(jù)starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)冠心病血瘀證相關(guān)miRNA 的靶基因，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的miRNA，設(shè)置CLIP 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的個(gè)數(shù)≥5，要求至少有5 個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)支持預(yù)測(cè)的結(jié)論，選擇至少在3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（包括PITA、RNA22、microT、miRmap、miRanda、PicTar、TargetScan）中有預(yù)測(cè)結(jié)果，以增加預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性與可信度。將檢索到的靶基因與冠心病血瘀證已知mRNA相互映射，構(gòu)建miRNA-mRNA 共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果符合共調(diào)控條件的有24 個(gè)miRNA（10 個(gè)上調(diào)、14 個(gè)下調(diào)）和22 個(gè)mRNA（10 個(gè)上調(diào)、12 個(gè)下調(diào)），利用OmicShare Tools繪制成圖（圖3）。

表2 冠心病血瘀證已知mRNA、miRNA

圖1 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)功能注釋

將miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNA 導(dǎo)入webgestalt 在線工具進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。富集結(jié)果KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)得到2條通路hsa05166（人T細(xì)胞白血病1型病毒感染）和hsa05167（卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染）。富集結(jié)果GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中三個(gè)層面Biological process、Cellular component 和 Molecular function（圖4）。

由于差異基因的富集程度越高，p值越小。因此按Pvalue 數(shù)值由小到大排列，選擇排名前10 的富集項(xiàng)目（表5），可見(jiàn)冠心病血瘀證miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及的核心基因有多功能細(xì)胞因子IL6，生長(zhǎng)因子EREG，受體IL6ST 和TNFRSF12A，轉(zhuǎn)錄因子EGR1、FOS、NFIB、TP53等。

表3 冠心病血瘀證蛋白質(zhì)互作功能模塊注釋

表4 顯著性富集的冠心病血瘀證差異mRNA通路

5 討論

研究梳理冠心病血瘀證差異基因的文獻(xiàn)研究成果，制作了冠心病血瘀證的基因數(shù)據(jù)表，構(gòu)建了冠心病血瘀證關(guān)鍵蛋白互作模塊。其中核心模塊MCODE1共有7 個(gè)關(guān)鍵蛋白，除算法識(shí)別的無(wú)記錄蛋白A2M 和IL1B 外，其余均有文獻(xiàn)記錄，同時(shí)研究數(shù)據(jù)均提示mRNA 表達(dá)下調(diào)。探討分析MCODE1 中5 個(gè)核心蛋白的功能及作用機(jī)制如下：白介素6（Interleukin 6，IL6）主要在急性和慢性炎癥部位產(chǎn)生，可在血清中通過(guò)IL6 受體α誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄性炎癥反應(yīng)。李國(guó)敏[16]研究發(fā)現(xiàn)IL6 單獨(dú)檢測(cè)診斷冠心病的陽(yáng)性率為90.0%。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（Early growth responsive gene-1，EGR1）作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可多方面調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、增殖。姚玉娟[17]研究推測(cè)EGR1 的促凋亡作用可能有廣譜性，其在心肌缺血及再灌注中都能促進(jìn)凋亡。腫瘤蛋白p53（Tumor protein p53，TP53）可編碼抑癌蛋白，誘導(dǎo)DNA修復(fù)或代謝改變，使細(xì)胞出現(xiàn)周期阻滯、凋亡、衰老，有助于維持基因的穩(wěn)定性，以減少突變發(fā)生。高彥霞等[18]研究推測(cè)miR-150-5p 可能通過(guò)抑制下游靶基因P53 蛋白調(diào)控Wnt信號(hào)通路誘發(fā)冠心病。

圖4 GO BP、GO MF、GO CC富集項(xiàng)目對(duì)比

表5 冠心病血瘀證miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)核心通路

激活蛋白-1（Activator protein-l，AP-l）包括Jun、Fos、Maf 和ATF 等眾多家族成員，原癌基因Jun（Jun proto-oncogene）和Fos（Fos proto-oncogene）都是AP-l的亞基。張紹潔等[19]研究推測(cè)c-Jun 表達(dá)上調(diào)可使基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白表達(dá)水平增高，認(rèn)為抑制c-Jun 活性可能有助于維持動(dòng)脈粥樣硬化中斑塊穩(wěn)定。李政等[20]研究發(fā)現(xiàn)心肌c-fos 基因在冠心病嚴(yán)重心肌缺血或缺血再灌注時(shí)異常表達(dá)，正常情況下很少或幾乎不表達(dá)。AP-1 可通過(guò)影響細(xì)胞（如炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞等）的增殖與凋亡[21]，參與許多心血管病的發(fā)展過(guò)程，而AP-l的下游則涉及大量的增殖、分化、死亡、生存相關(guān)基囚，如p53、p21、GM-CSF等。

在冠心病血瘀證相關(guān)的蛋白質(zhì)互作核心模塊MCODE2 中，4 個(gè)關(guān)鍵蛋白都是文獻(xiàn)的標(biāo)志蛋白，分析研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其mRNA 表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)。探討MCODE2 中4 個(gè)核心蛋白的功能及作用機(jī)制如下：組織蛋白酶L（Cathepsin L，CTSL），其mRNA 表達(dá)上調(diào)多出現(xiàn)于如炎癥因子、病原微生物、氧化應(yīng)激等各種原因?qū)е录?xì)胞損傷時(shí)。HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLADRB5 為 人 白 細(xì) 胞 抗 原（Human leukocyte antigen，HLA）的Ⅱ類抗原，均受控于HLA-D 區(qū)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多疾病與某些HLA 等位基因相關(guān)，如黃立娟等人[22]發(fā)現(xiàn)黑龍江漢族人的冠心病與HLA-DRB1 中的DR1、DR4 等位基因顯著相關(guān)。Xiong Yujuan 等人[23]研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*03:01:01G 和DQB1*05:03:01G 與南方漢人的冠心病發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。

同時(shí)，將納入基因數(shù)據(jù)按基因上、下調(diào)方向分別分析差異mRNA 的核心通路與病理作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證中上調(diào)mRNA 的GO 生物過(guò)程分析主要與細(xì)胞分泌和免疫代謝等相關(guān)，下調(diào)mRNA 的GO 生物過(guò)程分析主要與T 細(xì)胞分化、核減數(shù)分裂、促進(jìn)吞噬作用、血小板激活、生成趨化因子等相關(guān)。KEGG 通路富集分析顯示冠心病血瘀證中上調(diào)的mRNA 與造血細(xì)胞分化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)。Reactome 數(shù)據(jù)庫(kù)富集提示冠心病血瘀證中上調(diào)的mRNA 與血管壁的細(xì)胞表面相互作用有關(guān)，受損血管壁上的血小板可粘附白細(xì)胞，損傷促進(jìn)血小板和白細(xì)胞與內(nèi)皮發(fā)生一些關(guān)鍵的相互作用。

依據(jù)starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)和OmicShare Tools 構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖3），可見(jiàn)miRNA 中hsa-miR-106b-5p 與hsa-miR-20a-5p 關(guān) 聯(lián)的mRNA 最多，為關(guān)鍵調(diào)控基因。mRNA 中NFIB、RNF217、EREG、ADRB1 關(guān)聯(lián)的miRNA 最多，為核心調(diào)控基因。其中，核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）常以核因子I/B（Nuclear factor I/B，NFIB）形式存在于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，可調(diào)控如炎癥和免疫反應(yīng)等多基因的表達(dá)，如楊戈等[8]研究發(fā)現(xiàn)NFIB 在冠心病心絞痛患者中被明顯激活，許永紅[24]研究也提示冠心病患者的病變程度越嚴(yán)重其NF-κB水平越高。

環(huán)指蛋白217（Ring finger protein 217，RNF217）是泛素蛋白質(zhì)連接酶家族的成員，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，可通過(guò)C 端環(huán)指基序與HAX1 抗凋亡蛋白相互作用。表皮調(diào)節(jié)素（Epiregulin，EREG）參與炎癥、傷口愈合、卵母細(xì)胞成熟、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)過(guò)程，郝明輝等研究發(fā)現(xiàn)急性ST 段抬高型心肌梗死患者血清EREG 水平較高提示預(yù)后不良[25]。腎上腺素能受體1（Adrenoceptor beta 1，ADRB1）在調(diào)節(jié)血壓、心率、心肌收縮等方面十分重要，可介導(dǎo)去甲腎上腺素和腎上腺素的生理作用，是心肌細(xì)胞上分布最多的β腎上腺素能受體亞型。邵夢(mèng)嬌等發(fā)現(xiàn)ADRB1 可以通過(guò)改變離子通道特性造成心房肌電重構(gòu)[26]。功能注釋并分析miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNA，可知調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的mRNA 生物過(guò)程（GO BP）主要與生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程、發(fā)育歷程、對(duì)刺激的反應(yīng)相關(guān)（圖4）；其細(xì)胞組成（GO CC）主要與腔上包膜、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)復(fù)合體、核、內(nèi)膜體系相關(guān)；其分子功能（GO MF）主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合、離子結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)。冠心病血瘀證富集核心通路主要與炎癥和免疫反應(yīng)、病毒感染、細(xì)胞分化、RNA 轉(zhuǎn)錄相關(guān)（表5）。

同時(shí)，運(yùn)用starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建得到miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其中有10個(gè)核心miRNA與納入文獻(xiàn)資料中虞桂[10]和張?jiān)戮闧13]的研究結(jié)果吻合。張?jiān)戮暄芯堪l(fā)現(xiàn)miR-106b-5p 與細(xì)胞凋亡相關(guān)，miR-223-3p 和miR-24-3p 與血小板富集相關(guān)，其中miR-223-3p 還與血管內(nèi)炎癥有關(guān)。該研究構(gòu)建了以miR-106b-5p、miR-20a-5p、miR-19b-3p、miR-223-3p、miR-24-3p 為核心的冠心病血瘀證miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以miR-130a-3p、miR-15b-5p、miR-24-3p、miR-106b-5p、miR-144-3p 為 核 心 的miRNApathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，所涉及到8個(gè)miRNA均錄屬本研究miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。虞桂研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-199a-5p 和miR-146b-5p 可能通過(guò)下調(diào)TP53 和CALR 以減輕炎癥和凋亡，此觀點(diǎn)與本研究結(jié)果不完全相同。雖然與其所得核心miRNA 相同，但映射到的mRNA 不同。原因可能由于本研究在篩選時(shí)設(shè)置要求starBase中至少5個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)支持結(jié)論，并且3 個(gè)及以上數(shù)據(jù)庫(kù)（含PITA、RNA22、microT、miRmap、miRanda、PicTar、TargetScan）中可得到相同結(jié)果，以增加結(jié)果準(zhǔn)確性。而miR-199a-5p 和miR-146b-5p 在分別檢索時(shí)僅PITA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果支持靶標(biāo)為T(mén)P53 和CALR，在其他6 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)相同結(jié)論，不符合本研究的篩選條件，故未予納入。由此，本研究最終通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)映射，推測(cè)上調(diào)的miR-199a-5p 可使CTSL 上調(diào)、ARHGEF10 下調(diào)，上調(diào)的miR-146b-5p 可使FZD1上調(diào)。卷曲蛋白受體1（Frizzled class receptor 1，F(xiàn)ZD1）是典型Wnt 信號(hào)通路的跨膜受體，有研究發(fā)現(xiàn)FZD1上調(diào)在缺氧處理的新生大鼠心肌細(xì)胞中顯著可見(jiàn)，而沉默F(xiàn)ZD1 可明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌肥厚[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子10（Rho guanine nucleotide exchange factor 10，ARHGEF10）缺乏會(huì)抑制血小板功能和動(dòng)脈血栓形成[24]，從而影響冠心病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。由此可見(jiàn)，較以往的研究，本研究通過(guò)豐富的基因數(shù)據(jù)庫(kù)、嚴(yán)苛的篩選條件及研究間的數(shù)據(jù)互通，構(gòu)建了新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能為今后冠心病血瘀證的調(diào)控機(jī)制研究提供參考思路。

綜上，本次研究整理出了許多冠心病血瘀證標(biāo)志基因（113 個(gè)差異mRNA 和101 個(gè)差異miRNA），分析差異mRNA/蛋白質(zhì)間的功能通路和互作關(guān)系，獲得了冠心病血瘀證相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)功能注釋圖（圖1）和2組關(guān)鍵蛋白互作模塊（圖2），探討其差異基因的功能通路發(fā)現(xiàn)主要與炎癥和免疫反應(yīng)、凝血功能、細(xì)胞分化與凋亡等相關(guān)。研究豐富了冠心病血瘀證miRNA-mRNA 調(diào)控對(duì)，包含24 個(gè)miRNA（10 個(gè)上調(diào)、14 個(gè)下調(diào)）和22 個(gè)mRNA（10 個(gè)上調(diào)、22 個(gè)下調(diào)），對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展ceRNA 研究可能有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)本研究也存在一定局限性，研究設(shè)計(jì)時(shí)擬納入lncRNA，但獲取的lncRNA 數(shù)據(jù)在starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)lncRNA-mRNA、lncRNA-miRNA 預(yù)測(cè)時(shí)，結(jié)果無(wú)法與文獻(xiàn)miRNA、mRNA 數(shù)據(jù)重合。原因可能由于現(xiàn)有研究資料中l(wèi)ncRNA 數(shù)據(jù)較少，無(wú)法用多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)支持相同的結(jié)論，且部分文獻(xiàn)資料僅提供關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)或特異性較高的基因，使數(shù)據(jù)獲取不全面所致。上述探析結(jié)果可能為冠心病血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究帶來(lái)一些參考性的啟發(fā)，研究得到的冠心病血瘀證miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作機(jī)制，仍需進(jìn)一步的采用基因沉默或過(guò)表達(dá)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，更詳細(xì)的生物機(jī)理與疾病發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)行大量的后續(xù)研究。