血塞通軟膠囊干預冠心病血瘀證患者lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1調控網絡的臨床研究＊

董 艷，陳恒文，劉詠梅，朱 爽，馮嵐嵐，王 階

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

血塞通軟膠囊（XST）是臨床治療冠心病血瘀證的常用藥，其主要成分是三七總皂苷，它是傳統(tǒng)活血止血中藥三七的活性提取物。由于三七總皂苷包含數(shù)十種皂苷成分，作用靶點繁多，作用環(huán)節(jié)交錯，作用機制復雜，故而在一定程度上限制了XST 的臨床運用和療效發(fā)揮。而現(xiàn)有三七總皂苷治療冠心病的機制研究主要圍繞“中心法則”的單一基因或蛋白質[1-3]，結果分散、單一，難以形成清晰、系統(tǒng)的調控網絡。前期研究[4,5]已表明，冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證存在lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡，其中l(wèi)ncR CTB-114C7.4、miR-3656 是關鍵上游調控因子，能形成lncR CTB114C7.4-miR3656 網絡，參與細胞凋亡信號通路。因此，本研究采用臨床隨機雙盲安慰劑對照試驗觀察XST能否干預lncR CTB-114C7.4和miR-3656，以及細胞凋亡常見基因BCL2A1 mRNA 表達，以揭示其治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證的lncRNAmiRNA-mRNA 調控網絡。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2018年2月-2019年8月中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心血管科門診的冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者80 例。利用SPSS 23.0 軟件生成隨機分組方案，并進行隨機方案隱藏，試驗組和對照組各40 例。采用雙盲設計，以實現(xiàn)對受試者、研究者和數(shù)據統(tǒng)計者的盲法。研究過程中對照組脫落2 例，皆因療效欠佳退出；試驗組病例無脫落，故實際完成試驗78 人。本研究通過了倫理委員會的批準（批件號：2018-001-KY-01），并在“中國臨床試驗注冊中心”平臺完成國際注冊（注冊號：ChiCTR1800014980）。

1.2 納入標準

凡符合冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證診斷標準，年齡在40-80歲之間，且簽署知情同意書者均可納入。其中，疾病診斷標準參考2014年《ACC/AHA 非ST 段抬高型急性冠脈綜合征管理指南》；中醫(yī)證候診斷標準則參考1986年中國中西醫(yī)結合學會修訂的血瘀證標準。分別由2位中級職稱及以上中醫(yī)師進行獨立辨證，若意見不一致則參考第3 位中級職稱及以上中醫(yī)師的意見。

1.3 排除標準

本研究排除標準為：①心功能為Ⅲ級或Ⅳ級；②其他心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、或心臟神經官能癥等所致胸痛；③腦梗塞急性期；④合并肝腎功能不良；⑤合并其他嚴重原發(fā)?。ㄈ缪翰　⒛[瘤等）；⑥最近2周內有急性感染；⑦血壓或血糖控制不良，或伴有較嚴重的并發(fā)癥；⑧伴有精神系統(tǒng)疾病或智力障礙，不具備獨立完成問卷調查及隨訪工作者；⑨孕婦或哺乳期婦女。

1.4 治療方法

試驗組給予西醫(yī)基礎治療+XST，2 粒/次，每日2次；對照組給予西醫(yī)基礎治療+XST 模擬劑，2 粒/次，每日2 次。導入期為1 周，療程為4 周，導入期間停服其他具有活血化瘀作用的中藥湯劑及中成藥。試驗組和對照組藥物均由昆明圣火藥業(yè)集團有限公司提供，XST的規(guī)格為0.33 g/粒，國藥準字Z19990022；模擬劑的規(guī)格為0.33 g/粒，主要成分是淀粉，與XST 外觀、口感保持一致。

1.5 臨床觀察指標

本研究的臨床觀察指標包括3個方面：基線指標、療效指標和安全指標。其中基線指標為性別、年齡、吸煙、飲酒、體重指數(shù)、合并危險因素、用藥情況和血運重建情況等。療效指標為心絞痛療效、硝酸甘油停減率、中醫(yī)證候療效及單項中醫(yī)癥狀體征療效。安全指標包括血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂及凝血功能。

1.6 檢測lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網絡表達水平

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測試驗組和對照組治療前后外周血有核細胞中l(wèi)ncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網絡的表達水平。采集患者空腹時靜脈血樣4 mL，置于真空抗凝采集管中。分別進行靜脈血有核細胞分離與純化、有核細胞總RNA 提取、總RNA 濃度及純度測定、RNA 反轉錄和PCR擴增等實驗操作。

目的基因lncR CTB-114C7.4、miR-3656和BCL2A1的引物序列如下：lncR CTB-114C7.4，上游：TAACCTTTGATGTAGCTTGGTCTC，下 游：CATCATAAGACATCACAAAGAGGA；miR-3656，上 游：GGCGGGTGCGGGGGT，下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG；BCL2A1，上 游：CGTCCTACAGATACCACAACCT，下游：GATGCCGTCTTCAAACTCCT。

內參基因的引物序列如下：β-ACTIN，上游：GAGACCTTCAACACCCCAGCC，下游：AATGTCACGCACGATTTCCC；U6，上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.7 統(tǒng)計方法

運用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（Mean±SD）或四分位數(shù)表示。當進行兩組計量資料的比較時，若符合正態(tài)分布，采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗；若不符合正態(tài)分布，則采用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗或配對非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)或構成比表示，用卡方檢驗進行分析。按照ΔΔCt =(Ct目的基因- Ct內參基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組計算外周血中l(wèi)ncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 的2-ΔΔCt值 及 差 異 倍 數(shù)（fold change，F(xiàn)C），以分析網絡表達水平。所有數(shù)據均采用雙側檢驗，P≤0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 研究結果

2.1 基線情況

試驗組和對照組在性別（P= 0.098）、年齡（P=0.992）、吸煙（P= 0.065）、飲酒（P= 0.108）、體重指數(shù)（P= 0.549）、合并危險因素（P= 0.072）、用藥情況（P=0.257）和血運重建情況（P=0.816）等方面均無統(tǒng)計學差異，表明兩組具有可比性。

2.2 心絞痛療效

分別統(tǒng)計試驗組和對照組的心絞痛發(fā)作頻率（表1），比較治療前后的組間差異。結果顯示，兩組治療前的頻數(shù)分布無統(tǒng)計學差異（P=0.911），表明兩組治療前的心絞痛發(fā)作水平一致。經XST 治療4 周后，試驗組的心絞痛發(fā)作次數(shù)明顯減少，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（表1）。

表1 兩組患者心絞痛發(fā)作頻率表

2.3 硝酸甘油停減率療效

分別統(tǒng)計試驗組和對照組的硝酸甘油使用頻率（表2），比較治療前后的組間差異。結果顯示，兩組治療前的頻率分布無統(tǒng)計學差異（P=0.070），表明兩組治療前的硝酸甘油使用情況一致。經XST 治療4 周后，試驗組的硝酸甘油使用量顯著降低，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

表2 兩組患者硝酸甘油使用頻率表

2.4 中醫(yī)證候療效

采用《冠心病心絞痛血瘀證療效評價標準》[6]評價試驗組和對照組的血瘀證積分變化，比較治療前后兩組的變化值情況（表3）。根據該標準積分規(guī)則，分值越大表明血瘀證程度越重。同時，按照“減分率=100%”公式，計算兩組的尼莫地平減分率。根據減分率百分比“≥70%、≥30%、＜30%”，將療效分成3個等級，即“顯效、有效、無效”。

表3 兩組患者血瘀證積分值（Mean±SD）

結果顯示，治療前兩組的血瘀證積分無統(tǒng)計學差異（P=0.518），表明二者的血瘀證輕重程度一致。經XST 治療4 周后，試驗組的血瘀證積分明顯降低，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。減分率統(tǒng)計分析顯示，試驗組的平均減分率為34.44%，對照組則為6.63%。根據減分率百分比將臨床療效分為3組，試驗組顯效和有效共27 人（顯效2%，有效65%），無效13人（占33%）；對照組無效30 人（占79%），有效8 人（占21%），兩組的療效分布有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 單項中醫(yī)癥狀體征療效

分別統(tǒng)計試驗組和對照組的胸痛、胸悶、心悸、唇齦暗紅、舌紫暗及脈澀的臨床表現(xiàn)。根據《冠心病心絞痛血瘀證療效評價標準》對單項中醫(yī)癥狀體征的賦分規(guī)則，分別賦予不同的分值。去除治療前和治療后單項分值均為0 的病例，統(tǒng)計剩余患者各癥狀體征的變化值，當治療后分值較治療前下降時視為臨床治療有效。結果顯示，試驗組的胸痛治療有效率為80.65%，明顯優(yōu)于對照組29.73%，兩者有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）；試驗組的胸悶治療有效率為76.32%，優(yōu)于對照組41.18%，兩者有統(tǒng)計學差異（P= 0.002）；試驗組的唇齦暗紅治療有效率為32.26%，明顯優(yōu)于對照組8.82%，兩者有統(tǒng)計學差異（P=0.018）。同時，試驗組有緩解心悸、舌紫暗和脈澀的趨勢，但與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

2.6 安全性分析

分別統(tǒng)計試驗組和對照組的血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂及凝血功能等安全性指標，以評價藥物的臨床安全性。其中，血常規(guī)包括白細胞（white blood cell，WBC）、紅細胞（red blood cell，RBC）及血小板（platelet，PLT）；腎功能包括肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）；肝功能包括谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和 谷 丙 轉 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT）；凝血功能包括活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）；血脂包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density Lipoprotein，LDL）。試驗組治療后比治療前的血糖、LDL、AST 和ALT 含量下降，有統(tǒng)計學差異（P=0.019、P= 0.014、P= 0.006、P= 0.005），血常規(guī)、腎功能及凝血功能等指標在治療前后均無變化；對照組的各項指標在治療前后亦均無變化（表4）。該結果表明，XST具有調節(jié)血糖血脂水平和保護肝功能的作用，臨床運用安全。

2.7 外周血有核細胞lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1調控網絡的表達水平

根據血瘀證療效統(tǒng)計結果，選取試驗組中血瘀證治療有效的全部病例，經外周血有核細胞總RNA 濃度和純度檢測后確定20例為試驗組最終檢測樣品；同時，將對照組中所有無效病例按照尼莫地平減分率升序排列，選擇百分比最小的前20位作為對照組病例。運用qRT-PCR 檢測兩組治療前后的lncR CTB-114C7.4、miR-3656及BCL2A1表達水平（圖1）。

表4 兩組患者安全性指標統(tǒng)計表（Mean± SD）

圖1 調控網絡中各RNA的表達水平

以上結果表明，試驗組治療后比治療前的lncR CTB-114C7.4表達上調（FC=7.4），但差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.526）；miR-3656 表達下調（FC= -2.4），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；BCL2A1 表達顯著上調（FC=57.1），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.025）。而對照組治療后比治療前的lncR CTB-114C7.4和BCL2A1表達水平均無統(tǒng)計學差異（P= 0.332、P= 0.765），但對miR-3656 表達具有下調作用（FC= -1.3），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.040）。

進一步組間比較發(fā)現(xiàn)，治療前試驗組與對照組的lncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 表達水平均無統(tǒng)計學差異，表明兩組基因表達基線一致。治療后與對照組相比（表5），試驗組的lncR CTB-114C7.4 表達顯著上調（FC=35.1），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.046）；miR-3656 表達下調（FC= -1.9），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；BCL2A1 表達上調（FC= 9.0），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049）。

表5 治療后兩組調控網絡的相對差異表達水平

本研究表明XST 減少心絞痛發(fā)作、提高硝酸甘油停減率及改善中醫(yī)證候和單項癥狀體征的臨床療效存在微觀物質基礎。其潛在的作用機制為激活lncR CTB114C7.4 ↑-miR3656 ↓-BCL2A1 ↑調 控 網 絡。XST 上調lncR CTB114C7.4 表達后，lncR CTB114C7.4通過其miRNA 識別元件與miR-3656 結合，降低了游離miR-3656 表達水平，競爭性抑制了游離miR-3656與靶基因BCL2A1的結合，從而導致游離BCL2A1含量增多，而BCL2A1 作為編碼mRNA，能翻譯成BCL2A1蛋白質，進而表現(xiàn)出相應的功能。因此，XST介導的該調控網絡將最終由BCL2A1 發(fā)揮出相應的生物學功能，而lncR CTB114C7.4 和miR-3656 雖然不能直接翻譯蛋白，卻是激活該網絡的關鍵上游調控因子和中間環(huán)節(jié)。為了進一步驗證以上調控模式，并揭示該網絡介導的下游細胞學功能，我們后續(xù)開展了基于RNA 干擾技術的lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 敲降及過表達的細胞實驗，這將為明確XST 的lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑網絡作用機制提供更多的證據支撐，研究結果值得我們期待。

3 研究結論

通過臨床隨機雙盲安慰劑對照試驗，本研究獲得如下結論：①XST 治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者，不僅能減少心絞痛發(fā)作次數(shù)，提高硝酸甘油停減率；還能降低患者的血瘀證積分，將平均減分率從6.63%提高到34.44%，并改善胸痛、胸悶和唇齦暗紅的單項中醫(yī)癥狀體征。②XST 對患者血常規(guī)、腎功能及凝血功能等無影響，并能改善血糖血脂和肝功能指標，表明其臨床運用安全。③XST 在臨床運用有效和安全的前提下，能進一步上調患者外周血中l(wèi)ncR CTB-114C7.4 和BCL2A1 表達，并下調miR-3656 表達水平，從而發(fā)揮調節(jié)lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑網絡的作用。

4 討論與展望

lncRNA、miRNA 均為非編碼RNA，能調節(jié)下游mRNA 表達量，進而影響靶基因翻譯[7-10]，發(fā)揮相應的生物學功能。lncRNA 又屬于競爭性內源RNA[11]，含有miRNA識別元件，能與mRNA競爭相同的miRNA結合位點，從而抑制miRNA 與mRNA 的結合，影響miRNA對靶基因的調節(jié)作用。因此，lncRNA、miRNA、mRNA三者之間往往能形成lncRNA-miRNA-mRNA 網絡，參與體內的生理病理過程，是藥物干預的潛在作用靶點及調控機制。目前，已有研究[4，5,12]報道lncRNAmiRNA-mRNA 調控網絡參與了冠心病血瘀證的發(fā)生機制，而lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 作為上游非編碼RNA，能調節(jié)多種mRNA，進而影響細胞凋亡。BCL2A1 是BCL2 家族的主要基因之一，具有抗細胞凋亡的作用[13，14]，能保護心肌缺血再灌注損傷[15]。因此，本研究從lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網絡層面研究XST 的作用機制。相比早期單一靶點及機制的研究結果[16-18]，該研究有利于揭示中藥多靶點、多層次、整體調節(jié)的作用優(yōu)勢，從而促進中醫(yī)藥治療冠心病臨床療效的提高。