花生品種缺失過敏蛋白的篩選和品種間過敏原性的比較

高美須 王傳堂 許舒婷 牟 慧 王夢莉 姜小燕

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全收貯運管控重點實驗室,北京 100193;2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

食物過敏是指人體對食物過敏原產(chǎn)生的過敏反應,是食物中的正常營養(yǎng)成分所引起機體免疫系統(tǒng)的異常反應[1]。WHO 報道有超過40%的人曾受到食物過敏的困擾,食物過敏已成為當今世界普遍存在的食品安全問題。流行病學研究顯示,約33%的過敏反應由食物誘發(fā),而花生引起的食物過敏占其10%～47%[2]。葉世泰等1986年在我國常用食品致喘40例分析中指出,花生等油料作物位居食物過敏原的前列[3]。

我國是花生生產(chǎn)大國,產(chǎn)量居世界第一位,花生品質優(yōu)良,在國際市場上享有盛名,其出口貿易占國際花生市場約一半的份額[4]。過敏性疾病在醫(yī)學上無法根治,過敏患者只有通過避免食用含過敏原的食物才能得以避免過敏。篩選低致敏品種或致敏蛋白缺失的品種作為育種材料,用傳統(tǒng)或基因工程方法選育出含較少過敏原的花生品種,對降低花生過敏發(fā)病率和豐富過敏患者的食物種類都具有重要的現(xiàn)實意義。

花生中的蛋白是引起食物過敏的主要誘因,花生仁蛋白含量高達24%～36%。國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認可的花生過敏原有11種:Ara h 1～11,其中Ara h 1～3是國內外公認的主要過敏原。Ara h 1占花生總蛋白量的12%～6%,分子量為63.5 kDa[5],等電點為4.55,可被90%以上的花生過敏患者血清識別[6],熱穩(wěn)定性強,耐酸堿,不易被消化。Ara h 2約占花生蛋白總量的10%左右,等電點為5.2[7],屬于2S白蛋白家族,與許多種子儲藏蛋白有很大的同源性,同樣可被90%以上的花生過敏患者血清所識別。Ara h 2有兩個同種異型體:Ara h 2.01和Ara h 2.02,它們的相對分子量分別為17 kDa和20 kDa[8]。Ara h 3屬于大豆球蛋白類,可被45%的花生過敏患者血清所識別,文獻報道Ara h 3至少有5種同種異型體,相對分子量14～45 kDa[9]。P Rabjohn等[10]用分子生物學手段得到的重組Ara h3,其相對分子量為60 kDa,這也是國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認可的Ara h 3的相對分子量。花生的其他過敏原組分含量及致敏性都較低,研究也相對較少[11-12]。目前花生過敏蛋白的研究多集中在過敏原的檢測和降低過敏蛋白的致敏性方面,如免疫學中的印跡法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)等,以及生物傳感器、質譜法等檢測方法[13],胡純秋研究了用于過敏患者免疫治療的重組Ara h 2低致敏蛋白[14]。在品種的致敏蛋白缺失方面,關榮霞等分析了我國栽培大豆品種的過敏蛋白缺失情況[15],美國農(nóng)業(yè)部報道了一種不含Ara h 2過敏原的花生品種[16],尚未見我國栽培花生品種中有關過敏蛋白的報道。

我國是世界上保存花生種質最多的國家,本試驗選取中國5個不同品種類型4個省份的33個主栽花生品種,和日本的23個栽培品種為研究對象,利用我國對花生過敏的病人血清分析花生主要原Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的缺失情況,并進一步分析花生品種間致敏性差異,篩選出致敏蛋白缺失或低致敏性的品種,為花生過敏患者過敏提供低致敏花生食品以及低致敏花生育種提供支持。

表1 中國花生品種名稱與來源Table 1 Names and origin of Chinese peanut varieties

1 材料與方法

1.1 供試材料

33種中國花生的名稱、類型和栽培省份見表1。23種日本花生編號依次為JP-1～JP-23。所用品種由山東省花生研究所提供,2011年5月在青島種植,10月收獲。北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應科提供的8例花生過敏患者血清制備血清池,備用。預染的蛋白Maker(14.4～97.4 kDa,英國BiolabsInc公司);十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acr)和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等試劑購于美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

AE-8130型電泳儀和AE-6450型垂直電泳槽(日本ATTO 公司);DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-24D 型垂直電泳槽、DYCZ-40D 轉印芯和WD-9405B型水平搖床(均來自北京六一儀器廠);AlphaEase?FC凝膠成像系統(tǒng)、5cm 寬透析袋和硝酸纖維素膜(購自美國Sigma公司);TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);JY92-ⅡN超聲波粉碎細胞機(寧波新芝生物技術股份有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);電熱鼓風干燥箱(上?！憧茖W儀器有限公司);GS-04A粉碎機(北京錕捷玉誠機械設備有限公司);Genesis25XL冷凍干燥機(美國Virtis公司);QL-901渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 花生過敏原的提取

將精選的花生仁于電熱鼓風干燥箱內37.5℃,干燥1 h左右至紅衣易脫去,隨后少量多次用粉碎機粉碎。粉碎樣品采用直接浸提法,即每克花生粉加入7 mL正己烷過夜低溫振蕩脫脂,10000 r/min 4℃離心10 min后傾去上清液正己烷,沉淀于通風櫥室溫風干,過60目篩得脫脂花生粉,密閉低溫保存。脫脂花生粉按1:20(m/v)加入10 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4,0.15 mol/L NaCl),在0℃超聲波破碎細胞壁處理,選擇參數(shù)為200 W,超聲5 s,間隔2 s,超聲60次。超聲后的脫脂花生粉溶于磷酸鹽緩沖液中,12000 r/min 4℃離心15 min,其上清液即為花生過敏蛋白液。將得到的花生過敏蛋白液4℃透析48 h,期間間歇性地攪拌透析液。透析過的過敏蛋白液經(jīng)冷凍干燥后得到過敏蛋白粉,冷凍儲存?zhèn)溆肹17-18]。

1.3.2 過敏原的SDS-PAGE電泳分析

參照Laemmli的方法[19],用不連續(xù)凝膠垂直板電泳來測定花生過敏蛋白的蛋白質分子量,用美國AlphaEase?FC凝膠成像系統(tǒng)進一步分析出各主要花生過敏蛋白的相對含量。

蛋白相對含量/%=(單條泳道單個灰度值/單條泳道總條帶灰度值)×100

1.3.3 免疫印跡鑒定

免疫印跡實驗,將樣品經(jīng)過不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉移條帶至硝酸纖維素膜上,封閉后,進一步用一抗二抗孵育,孵育完洗膜,顯色處理來鑒定花生過敏蛋白存在的情況。

1.3.4 花生蛋白過敏原性測定

采用間接ELISA 方法[7],確定抗原包被濃度為1μg/mL,抗原稀釋度為1:500,封閉后,進一步用一抗二抗孵育,孵育后加TMB顯色15 min左右,加ELISA終止液終止反應,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定酶標板各孔450 nm 下的光密度OD值。

2 結果與分析

2.1 56個花生品種的過敏蛋白種類比較

花生中主要過敏原有8種,即Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 2(20、17 kDa)和Ara h 3(39、35、30、24和14 kDa)。33種中國花生品種的SDS-PAGE電泳結果如圖1,Marker的分子量介于7 kDa至175 kDa。從電泳圖譜可看出,所有中國花生品種均含有分子量為63.5 kDa的Ara h 1。Ara h 2有分子量為20 kDa和17 kDa的兩個同種異型蛋白,中國花生品種中沒有發(fā)現(xiàn)缺失這兩種蛋白的花生品種。對有4種不同蛋白的Ara h 3,沒有在這33種花生品種中發(fā)現(xiàn)缺失Ara h 3(39,30,14 kDa)的品種,但在普通型的花生品種中發(fā)現(xiàn)了有過敏蛋白條帶Ara h 3(35 kDa)缺失的品種14號綏中大花生和17號沭陽大站秧,過敏蛋白條帶Ara h 3(24 kDa)缺失的品種11號新金伏大、12號興城大花生和16號如東碗兒青。除了普通型發(fā)現(xiàn)缺失過敏蛋白條帶外,編號19～25的多粒型花生、編號26和27的龍生型花生、以及編號28和29的中間型花生中,均未發(fā)現(xiàn)8種主要過敏蛋白條帶缺失的品種。

從電泳圖譜上看,日本花生品種與中國花生品種間差異不是很顯著,品種間主要過敏蛋白條帶分布相似。與中國花生品種一樣,Ara h 1(63.5 kDa)的條帶顏色最深,寬度最寬,含量最高,所有日本花生品種中沒有缺失該蛋白的品種。也沒出現(xiàn)缺失Ara h 2(20,17 kDa)的品種。只有JP-16與JP-19的Ara h 3(24 kDa)有缺失,其他品種沒有發(fā)現(xiàn)過敏蛋白Ara h 3條帶的缺失。

圖1 中國不同品種花生過敏原的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE map of Chinese peanut allergen

圖2 日本不同品種花生過敏原的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE map of Japanese peanut allergen

2.2 56個花生品種的過敏蛋白含量比較

從電泳圖譜中可看出花生品種中主要致敏蛋白的條帶是否有缺失,但對過敏原的含量并不清楚,無法客觀地分析花生品種間的致敏性差異。因此需要采用美國AlphaEase?FC凝膠成像系統(tǒng)分析各主要花生過敏蛋白的相對含量,進一步科學地分析花生品種間的過敏原含量的差異。

從表2可得出,Ara h 1(63.5 kDa)相對含量最高,其在中國花生品種中的含量分布為25.0%～47.6%?；ㄉ贩N的類型不同,其Ara h 1的相對含量也不一樣,總的來說,各類型Ara h 1的相對含量的順序為中間型＞龍生型＞普通型＞多粒型＞珍珠豆型。從地域分布上來看,山東＞遼寧＞江蘇＞福建。含量最高的是編號為25的即墨小紅墩,含量達到了47.6%。含量最低的是編號為6的花育20號,含量為25.0%。其中珍珠豆型的2號和7號品種的Ara h 1含量明顯低于其他品種。對于

過敏原Ara h 2 (20 kDa),其相對含量在4.9%～14.0%之間。所研究的中國花生品種中約70.0%的花生品種含量都大于7.0%。總體上Ara h 2(17 kDa)相對含量比Ara h 2(20 kDa)低,在0.2%～11.7%之間。其中11號新金伏大、16號如東碗兒青、26號長清一叢生、29號魯花10號Ara h 2(17 kDa)的相對含量低,均在1.0%以下。

Ara h 3(39 kDa)的相對含量在3.0%～9.5%之間。Ara h 3(35 kDa)的相對含量最高為8.1%。Ara h 3(30 kDa)的相對含量在1.8%～10.0%之間,其中約42%的品種其含量低于5.0%。Ara h 3(24 kDa)的相對含量較低,在0%～6.0%之間。Ara h 3(14 kDa)相對含量較高,在0.9%～16.7%之間。比較而言,珍珠豆型和普通型花生的致敏蛋白含量要高于多粒型。

表2 中國花生主要過敏原相對含量Table 2 The relative content of major allergens in Chinese peanut/%

日本花生品種中Ara h 1(63.5 kDa)的相對含量同樣是在所有過敏蛋白中含量最高的,其含量分布為20.2%～39.6%,低于中國的花生品種。國內外的研究均表明Ara h 1的含量在所有的過敏原中是最高的,與本研究結果相一致。Ara h 2(20 kDa)的相對含量在5.6%～12.2%之間,Ara h 3(39 kDa)、Ara h 3(35 kDa)的相對含量均在3.4%～10.0%之間,Ara h 3(30 kDa)的相對含量在3.1%～8.6%之間,與中國花生相似,Ara h 2(17 kDa)在日本花生品種中的含量高于中國的,含量在1.2%～11.2%之間。Ara h 3(24 kDa)的相對含量最高為6.5%,JP-16、JP-19缺失此過敏蛋白條帶。Ara h 3(14 kDa)的相對含量較高,在3.2%～15.9%之間。

表3 日本花生主要過敏原相對含量Table 3 The relative content of major allergens in Japanese peanut/%

圖3 中國花生過敏原的電泳/免疫印跡圖譜Fig.3 SDS-PAGE/Western blotting of Chinese peanut allergens

圖4 日本花生過敏原的電泳/免疫印跡圖譜Fig.4 SDS-PAGE/Western blotting of Japanese peanut allergens

2.3 花生品種過敏蛋白的過敏原性比較

過敏原的過敏原性的鑒定需免疫印跡圖來確定。為有效利用患者血清,我們僅選取代表性的花生品種進行試驗,免疫印跡如圖3、圖4所示?？梢杂^察到,主要過敏蛋白Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 3(30、24 kDa)在免疫印跡圖中可清晰地識別,這3種蛋白很可能是引起中國花生過敏病人的主要蛋白,而其他5種過敏蛋白條帶只能模糊觀察到。日本花生品種的免疫印跡圖基本和中國品種的相同,都是Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 3(30、24 kDa)這3條條帶與花生過敏患者的血清產(chǎn)生了反應。

表5 日本花生品種間接ELISA 免疫原性 (OD 值)Table 5 Optical density of ELISA of Japanese peanut

2.4 56個花生品種蛋白的過敏原性比較

從電泳圖譜和免疫印跡圖譜中得出不同花生品種間,過敏原的種類和相對蛋白含量均有差異,但是對于過敏原總體上免疫活性的高低還需要間接ELISA的方法從量上進行分析。下表中所得數(shù)據(jù)均是ELISA試驗結果,其OD值越高,過敏原性越強。從表4中發(fā)現(xiàn),所測得的中國花生品種的OD值在0.402～0.889之間,最低的是20號鐵嶺四粒紅,最高的是19號營口四粒紅。不同品種類型沒有明顯差異。從表5中發(fā)現(xiàn),日本花生品種的OD值在0.315～0.477之間,JP-10的致敏性最強,JP-6的致敏性最低。JP-16和JP-19均有過敏原條帶的缺失,但是其OD值并不是最小的。

3 討論

3.1 花生品種中發(fā)現(xiàn)缺失蛋白的品種

本實驗從56個中國和日本花生品種中發(fā)現(xiàn)7個有致敏蛋白缺失,證實了花生品種中某種致敏蛋白缺失情況的存在。美國的報道是從300多個花生品種中找到1 個過敏蛋白Ara h 2 缺失的品種[16],我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)Ara h 2缺失,卻發(fā)現(xiàn)了Ara h 3(24、35kDa)兩個致敏蛋白缺失的品種,也說明了不同地區(qū)花生品種致敏蛋白缺失的條帶可能不同。本研究品種的采集包括珍珠豆型、普通型、多粒型、龍生型和中間型,在所有類型的中國花生品種中,只有來自遼寧和江蘇的普通型品種存在過敏原的缺失,即14號綏中大花生和17號沭陽大站秧缺失過敏原Ara h 3(35 kDa),11號新金伏大、12號興城大花生、16號如東碗兒青缺失Ara h 3(24 kDa)。下一步需要研究這些致敏蛋白缺失品種間是否有親緣關系,并進行進一步的分子水平驗證,為低致敏花生育種提供科學的材料。

3.2 花生中過敏蛋白種類含量和過敏原性的關系

本研究發(fā)現(xiàn)缺失Ara h 3的花生品種14號綏中大花生、17號沭陽大站秧、11號新金伏大、12號興城大花生和16號如東碗兒青的過敏原性并不比其他品種低,17號品種的過敏原性還處于較高的水平(OD 值0.799),這可能和所用的病人血清對缺失蛋白不夠敏感,或對其他過敏蛋白更敏感有關。在過敏原蛋白條帶分析與相對含量分析過程中,對于缺失或個別過敏蛋白含量很低的品種,測得的過敏原性OD 值都不是最低的,由此可見,花生的致敏性并不單一地被條帶的缺失或含量高低所限制,因此花生品種的過敏性與其過敏蛋白種類或含量之間并不存在線性關系。因此找到了缺失一種過敏蛋白的花生品種,只是為解決問題提供了一種可能性。過敏反應是人體的復雜病理過程,作物品種和人類個體差異均是造成過敏反應不同的因素,本研究中日本花生品種的過敏原性相對于中國的品種弱一些,可能與花生過敏患者血清來自中國過敏患者有關。

4 結論

56個花生品種中過敏蛋白Ara h 1的含量最高,Ara h 2、Ara h 3的含量次之。在中國普通型花生品種的14號綏中大花生和17號沭陽大站秧中發(fā)現(xiàn)缺失過敏蛋白Ara h 3(35 kDa),11號新金伏大、12號興城大花生、16號如東碗兒青、日本花生品種JP-16和JP-19缺失過敏蛋白Ara h 3(24 kDa)。決定花生的致敏性因素復雜,單純過敏蛋白條帶的缺失或含量高低與花生致敏性沒有線性關系。