血小板內(nèi)活性氧在血小板活化中作用機(jī)制及其靶向治療的應(yīng)用進(jìn)展

陳錦遠(yuǎn) 李春霖 王秋根 鄧國(guó)英

血小板是血液中的重要成分, 在止血、炎性反應(yīng)及血栓形成以及器官移植排斥等生理與病理反應(yīng)中具有重要作用。血管出現(xiàn)損傷時(shí),生理性血小板活化能迅速形成血栓封閉傷口實(shí)現(xiàn)止血。病理性血小板異常活化則會(huì)誘導(dǎo)閉塞性血栓的形成,增加人們罹患缺血性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

生理性止血過(guò)程中血小板需要經(jīng)歷黏附、活化、聚集的過(guò)程。血管受損時(shí)，膠原蛋白和von illebrand因子(von willebrand factor, VWF)暴露，血小板通過(guò)其表面的GPⅠb-IX-V受體和GPVI受體分別與VWF和膠原蛋白結(jié)合，迅速活化并牢固粘附于內(nèi)皮下基質(zhì)[1-2]?；罨盘?hào)將導(dǎo)致血小板細(xì)胞骨架改變并在膠原表面鋪展開，血小板改變形態(tài)同時(shí)釋放α顆粒、致密顆粒以及溶酶體的內(nèi)容物[3]。血小板活化涉及許多血小板激動(dòng)劑與其配體的結(jié)合，如腺苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)和血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)，分別與P2Y受體和血栓素受體(thromboxane receptor, TP)結(jié)合，以加強(qiáng)αIIbβ3依賴性血小板聚集[4]。同時(shí)受損血管內(nèi)皮中與TXA2拮抗的PGI2生成減少，也有利于血小板的聚集。血小板活化時(shí)，整合素αIIbβ3從低親和狀態(tài)活化至高親和狀態(tài)，其配體包括纖維蛋白原，VWF及纖連蛋白等。血小板之間通過(guò)整合素αIIbβ3共同結(jié)合纖維蛋白原等配體從而聚集成團(tuán)，并與白細(xì)胞相互作用共同形成血栓堵塞傷口以保持血管壁完整性。

雖然這些相互作用對(duì)于血小板活化極為重要，但是同時(shí)也與動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈高血壓和血栓形成相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),GPVI和GPIb-IX-V在異常病理剪切應(yīng)力和血流改變(例如在狹窄動(dòng)脈內(nèi))中血小板血栓形成的起始階段起關(guān)鍵作用，并且在腦血管性中風(fēng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衅鹗佳ㄐ纬芍衅鹬匾饔肹7]。在生物進(jìn)化過(guò)程中，血小板的出現(xiàn)是為了控制出血延續(xù)生命，然而目前血栓性或心血管疾病卻是導(dǎo)致全球范圍人類疾病死亡的主要原因，且現(xiàn)有治療方案存在局限性。血小板活化信號(hào)在止血和血栓形成中的作用中起關(guān)鍵作用，一直以來(lái)都是學(xué)界深入研究的主題，希望能從中找到治療血栓性或心血管疾病的突破口。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機(jī)體有氧呼吸的正常代謝產(chǎn)物，包括超氧陰離子(O2-)，過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(HO)等。ROS不僅可以直接損傷DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等體內(nèi)重要物質(zhì)，還可以通過(guò)影響正常狀態(tài)下活性氧的第二信使功能造成間接損傷，與動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病，神經(jīng)退行性改變以及衰老等密切相關(guān)[8-10]。與此同時(shí)，ROS也可以通過(guò)與靶蛋白的特定原子的化學(xué)反應(yīng)傳遞信號(hào)、修飾共價(jià)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中扮演相當(dāng)重要的角色[11]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)ROS可以調(diào)控活化信號(hào)影響血小板功能，是預(yù)防和治療血栓性或心血管疾病的潛在位點(diǎn)[12-13]。目前ROS活化血小板可能的機(jī)制有GPVI依賴性血小板活化途徑和NO/ sGC /cGMP通路，本篇綜述將討論ROS在血小板活化中的作用及其靶向治療的可能。

1.活性氧參與血小板活化進(jìn)程的機(jī)制研究進(jìn)展

健康人血小板細(xì)胞內(nèi)含有一定水平的ROS，實(shí)驗(yàn)證明ROS參與血小板的活化和聚集[14-15]。過(guò)氧化氫酶誘導(dǎo)的細(xì)胞中H2O2的減少會(huì)抑制血小板聚集，而過(guò)氧化氫酶缺乏將促進(jìn)血小板活化。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是生理ROS的主要來(lái)源，用NOX抑制劑處理的或來(lái)自X-連鎖慢性肉芽腫病患者的血小板，其催化作用的NOX亞基gp91 phox中存在遺傳缺陷，表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員和血小板活化功能的降低[16]。此外，使用ROS清除劑或O2?-生產(chǎn)抑制劑[夾竹桃麻素(Apocynin)和過(guò)氧化氫酶]會(huì)抑制血小板活化，而產(chǎn)生ROS的物質(zhì)如2,3-二甲氧基-1,4-萘醌(2,3-dimethoxy-1,4-naphthoquinone, DNMQ)增強(qiáng)血小板活化[16]。近年來(lái)，對(duì)于ROS在血小板中的作用機(jī)制已有初步探索，本文將介紹ROS在GPⅥ依賴性血小板活化途徑和NO/ sGC /cGMP途徑中的作用。

2.活性氧與GPⅥ依賴性血小板活化途徑

糖蛋白VI (glycoprotein VI, GPVI)是一種僅在血小板和巨核細(xì)胞上表達(dá)的糖蛋白受體，其主要配體為膠原蛋白，在膠原介導(dǎo)的血小板活化中起到重要作用。GPVI由兩個(gè)細(xì)胞外Ig結(jié)構(gòu)域，短粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾構(gòu)成[17]。GPVI細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括一段與鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)結(jié)合的膜近端帶正電序列，另一段與Src家族激酶的Fyn、Lyn結(jié)合的富含脯氨酸的序列，二者參與GPVI依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。GPVI與Fc受體γ鏈(Fc receptor γ-chain, FcRγ)通過(guò)非共價(jià)鍵連接形成復(fù)合體，這對(duì)于膠原結(jié)合GPVI介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。GPVI /FcRγ的交聯(lián)通過(guò)Src家族激酶Lyn使得FcRγ細(xì)胞質(zhì)尾部?jī)?nèi)基于免疫受體酪氨酸的活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)的磷酸化，導(dǎo)致脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)的募集和組裝，以及隨后的各種銜接蛋白的激活，最終導(dǎo)致磷脂酶Cγ2(phosholipase Cγ2, PLCγ2)的激活[19]。PLCγ2引起細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+升高并導(dǎo)致整合素αIIbβ3的活化，導(dǎo)致血小板聚集[2]。

NOX家族是在生物膜上轉(zhuǎn)移電子的蛋白質(zhì)，由膜亞基(p22 phox和gp91 phox)和胞質(zhì)組分(p47 phox，p67 phox，p40 phox和Rac)構(gòu)成，是人體血小板生理狀態(tài)下ROS的主要來(lái)源，涉及宿主防御，蛋白質(zhì)加工，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化等功能[20-21]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中鑒定出7個(gè)NOX家族成員(NOX1-5和DUOX1-2)，且已經(jīng)在人和小鼠血小板中證實(shí)了NOX1和NOX2的表達(dá)[22]。對(duì)于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF4)的研究證明了GPVI與ROS存在關(guān)聯(lián)。TRAF4是GPVI的新型配體，可以選擇性結(jié)合GPVI的細(xì)胞質(zhì)尾部，并與NOX2的亞基p47 phox相互作用進(jìn)而產(chǎn)生ROS[23]。此外，TRAF4還與其他信號(hào)蛋白如Pyk2和Hic-5相互作用，這些信號(hào)蛋白的結(jié)構(gòu)與Lyn相關(guān)。Lyn是GPVI依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，其與p47 phox磷酸化和隨后易位至膜表面所必需的蛋白激酶C(PKC)δ相關(guān)[24]。在GPVI信號(hào)傳導(dǎo)中，TRAF4可以通過(guò)Hic-5和Pyk2連接Lyn，通過(guò)Lyn連接PKC-δ，通過(guò)p47phox連接NOX。這將觸發(fā)p47 phox磷酸化和隨后NOX1 / 2的激活，從而激活下游Syk依賴性或Syk非依賴性通路，導(dǎo)致血小板聚集。血小板中ROS可以通過(guò)激活蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)對(duì)HIC-5/Lyn進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此GPVI刺激產(chǎn)生的ROS使得SHP-2氧化失活，促進(jìn)信號(hào)分子上酪氨酸殘基的磷酸化，最終導(dǎo)致PLCγ2活化和血小板聚集[25-26](圖1)。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPx1)/過(guò)氧化氫酶是清除H2O2的酶，缺乏這兩種酶的小鼠體內(nèi)SHP-2氧化水平上升，血小板粘附/聚集增強(qiáng)，表明H2O2是血小板中SHP-2氧化失活的原因[27]。

圖1 ROS與GPⅥ依賴性血小板活化途徑

3.活性氧與NO/sGC/cGMP途徑

內(nèi)皮細(xì)胞衍生的前列腺素和一氧化氮(NO)是兩大內(nèi)源性血小板抑制劑，分別通過(guò)增加血小板循環(huán)核苷酸cAMP 和 cGMP 的水平抑制血小板活化。NO/cGMP是血小板活化的主要負(fù)性調(diào)控途徑，能抑制血小板聚集和粘附到血管壁。內(nèi)源性或藥物衍生的NO能活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)，顯著提高血小板中的cGMP水平以強(qiáng)烈抑制血小板活化，并且通常與前列環(huán)素導(dǎo)致的 cAMP升高協(xié)同作用[28]。cGMP升高可以抑制血小板激動(dòng)劑介導(dǎo)的整合素活化，顆粒釋放，TXA2合成與釋放，以及細(xì)胞骨架重排[29]。這些步驟對(duì)于血小板形態(tài)改變，黏附和聚集十分關(guān)鍵。早期的研究表明，急性抑制內(nèi)源性NO生成可以誘導(dǎo)血小板的快速活化。ROS可以通過(guò)將NO轉(zhuǎn)化為ONOO-， ONOO -可以進(jìn)一步與酪氨酰殘基反應(yīng)形成3-NO2-Tyr和與硫醇以產(chǎn)生S-亞硝基硫醇(RS-NO)，這些轉(zhuǎn)變可以抑制內(nèi)源性NO生成從而降低NO對(duì)血小板活化的抑制作用[30-32]。另外，ONOO -可以充當(dāng)COX過(guò)氧化物酶底物，導(dǎo)致前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶激活和前列腺素形成增加，這些反應(yīng)對(duì)血小板中TXA2的合成十分重要[33]。此外，ONOO -可能增強(qiáng)二磷酸腺苷的生物利用度，從而增加額外的血小板聚集。

最近的研究提出了NO/sGC /cGMP/PKG信號(hào)通路的新概念，該信號(hào)通路在調(diào)節(jié)血小板活化中存在雙相作用：在血小板活化期間內(nèi)源性合成的低濃度NO和cGMP能促進(jìn)血小板活化并增加血小板對(duì)激動(dòng)劑的敏感性；高濃度的NO和cGMP類似物通過(guò)cGMP依賴性的cAMP升高和cAMP依賴性蛋白激酶的活化對(duì)血小板活化起抑制作用[34](圖2)。然而這一雙相作用觀點(diǎn)存在著較大爭(zhēng)議，其他研究提示NO/ sGC /cGMP通路作用于許多其他信號(hào)通路而不只是PKG，ROS與NO/sGC/cGMP信號(hào)通路之間的關(guān)系值得進(jìn)一步探究[35-36]。

圖2 ROS與NO/sGC/cGMP途徑

4.應(yīng)用進(jìn)展

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)是目前人類健康的重大威脅，其標(biāo)準(zhǔn)治療即雙重血小板治療存在復(fù)發(fā)或者增加出血傾向等局限性，因此有效地防止血栓生長(zhǎng)同時(shí)對(duì)生理止血具有最小影響的抗血小板藥物的開發(fā)極具價(jià)值[37]。針對(duì)GPⅥ依賴性血小板活化途徑，目前已從GPVI類似物、GPVI抗體、下游Syk抑制劑等各方面展開研究并取得一定成果[38]。前文我們已經(jīng)介紹NOX1/2產(chǎn)生的ROS能促進(jìn)血小板粘附、聚集和血栓形成，因此NOX1/2可能是潛在的靶向治療位點(diǎn)，靶向NOX1/2亞基以減少ROS產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)抑制血小板活化的思路對(duì)于抗血栓治療具有極大價(jià)值。針對(duì)ROS和NO/sGC/cGMP途徑之間的關(guān)系，部分研究發(fā)現(xiàn)多種天然提取物可以增加血小板內(nèi)源性抑制機(jī)制，這也是抗血栓治療的潛在應(yīng)用方向。

(1) NOX抑制劑：NOX1和NOX2都是動(dòng)脈剪切時(shí)膠原介導(dǎo)的血栓形成所必需的[39]。對(duì)于NOX1、NOX2和ROS之間關(guān)系仍存在疑問(wèn)，有研究發(fā)現(xiàn)是NOX1和NOX2在血小板活化期間發(fā)揮不同的作用，NOX1在小鼠中GPCR介導(dǎo)的血小板活化中起重要作用，但在由CRP誘導(dǎo)的GPVI依賴性血小板活化不是必需的，而NOX2在凝血酶和GPVI依賴性ITAM信號(hào)傳導(dǎo)途徑中至關(guān)重要[26]；使用特異于NOX1的ML171(2-乙?；脏玎?以及NOX2缺陷小鼠的藥理學(xué)抑制劑的研究表明，是NOX1而非NOX2負(fù)責(zé)GPVI依賴性ROS產(chǎn)生和TXA2產(chǎn)生[39]；新的研究稱NOX2并非是導(dǎo)致血小板活化和血栓形成的ROS的主要來(lái)源，同時(shí)另外一組實(shí)驗(yàn)用Rac1-/-或特異性Rac抑制劑NSC23766處理的人血小板中CRP誘導(dǎo)的ROS顯著減少，但發(fā)現(xiàn)其出血時(shí)間并沒(méi)有縮短[40]。此外，NOX2-/-血小板顯示出GPVI依賴性血小板活化期間ROS產(chǎn)生和Ca2+動(dòng)員在減少。雖然還需要更加深入的研究NOX1/2在不同病理生理?xiàng)l件下GPVI依賴性ROS產(chǎn)生中的相對(duì)作用，但靶向NOX1/2減少ROS產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)抑制血小板活化的思路具有十足潛力。

根據(jù)特異性，NOX抑制劑分為非特異性，NOX1特異性和NOX2特異性抑制劑。非特異性抑制劑包括二聯(lián)苯碘(diphenyliodonium, DPI)，夾竹桃麻素(Apocynin)等。DPI通過(guò)抑制黃素蛋白來(lái)阻斷ROS的產(chǎn)生。Apocynin被廣泛用于中風(fēng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，其抑制機(jī)制是通過(guò)阻斷NOX亞基p47phox遷移到膜表面形成具有功能的NOX復(fù)合體的過(guò)程。Apocynin的抑制作用有時(shí)需要髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的參與，apocynin在MPO含量較少的細(xì)胞中只能清除ROS而不能抑制NOX減少ROS的產(chǎn)生[41]。雖然通常認(rèn)為apocynin是NOX的非特異性抑制劑，但也有實(shí)驗(yàn)提示其對(duì)NOX2存在一定特異性[42]。

NOX1特異性抑制劑有2-乙酰基吩噻嗪(2-acetylphenothiazine, 2-APT)和NoxA1ds等。2-APT 是NOX1特異性抑制劑，通過(guò)削弱GPVI特異性激動(dòng)劑CRP對(duì)整合素αIIβ3和PKC的激活作用，最終影響膠原對(duì)Syk的激活作用[43]。NoxA1ds是一種多肽，可以模擬一個(gè)與p67phox激活域同源的Nox1激活子亞基NoxA1的假定的激活域。P67phox激活域能使NOX1產(chǎn)生的ROS減少95%，研究證實(shí)NoxA1也能發(fā)揮相同作用[44]。

NOX2特異性抑制劑包括Nox2ds-tat和PR-39等。Nox2ds-tat又名gp91ds-tat，是最具特異性同時(shí)也是最廣為使用的NOX2抑制劑。Nox2ds-tat可以特異性結(jié)合p47phox并防止NOX2的組裝[41]。PR-39的抑制機(jī)制可能是通過(guò)與p47phox中的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合并干擾其與p22phox的C末端內(nèi)的脯氨酸域(PRDs)的結(jié)合，從而干擾NOX組裝[44]。

(2) 增強(qiáng)內(nèi)源性抑制機(jī)制的天然產(chǎn)物：除了靶向NOX1/2，抑制血小板活化也可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性機(jī)制的途徑，包括提高細(xì)胞內(nèi)cAMP與cGMP以及使用抗氧化劑等[45]。cAMP和cGMP分別通過(guò)激活cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶，誘導(dǎo)血管擴(kuò)張劑激動(dòng)的磷蛋白(VASP)磷酸化，并減弱細(xì)胞骨架重組和整合素的激活[46]。多種天然產(chǎn)品或提取的生物活性成分可以下調(diào)氧化應(yīng)激和干擾多條信號(hào)通路中的受體或配體達(dá)到抑制血小板活化的目的[47]。最近的研究已證明人參的活性成分(人參皂苷RP3)能通過(guò)SFK /PLCγ2/Ca2+，cAMP/P-VASP和MAPK最終阻止整合素αIIbβ3a的活化，抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，從而減少體內(nèi)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[48]。對(duì)血小板活化聚集的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的進(jìn)一步研究可能揭示新的潛在靶標(biāo)并為抗血栓藥物的研發(fā)帶來(lái)新思路。

5.結(jié)論

血小板活化信號(hào)在止血和血栓形成中的作用中起關(guān)鍵作用，ROS可以調(diào)控活化信號(hào)影響血小板功能。ROS通過(guò)在GPⅥ依賴性血小板活化途徑中氧化SHP-2和通過(guò)NO/sGC/cGMP途徑中將NO轉(zhuǎn)化為ONOO-、增加TXA2的合成來(lái)促進(jìn)血小板活化。NOX是機(jī)體中ROS的最主要來(lái)源，靶向NOX1/2或增強(qiáng)內(nèi)源性抑制機(jī)制可以減少ROS產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)對(duì)血小板活化的抑制。血栓性或心血管疾病是導(dǎo)致全球死亡的主要原因，ROS影響血小板的具體機(jī)制可以指導(dǎo)相關(guān)治療，因此對(duì)機(jī)制進(jìn)一步的探索極具價(jià)值。