山羊傳染性胸膜肺炎免疫學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展

吳婭琴，顏新敏，郝華芳，陳勝利，馬麗娜，儲(chǔ)岳峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

山羊傳染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)引起山羊的一種嚴(yán)重的呼吸道疾病，被世界動(dòng)物組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染病之一。超急性病例出現(xiàn)輕微癥狀后1～3 d死亡；急性病例表現(xiàn)為高燒(41～43℃)，劇烈頻繁的咳嗽，一般在7～10 d內(nèi)死亡。新發(fā)疫區(qū)發(fā)病率達(dá)60%，死亡率90%[1]。老疫區(qū)常呈慢性發(fā)病經(jīng)過，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期咳嗽和消瘦。急性和亞急性疾病剖檢變化特征是單邊漿液纖維素性胸膜肺炎并伴有嚴(yán)重的胸腔積液[2]。

CCPP病原不易分離，1873年，CCPP在阿爾及利亞被首次報(bào)道[3]，但直到1976年，Mccp才首次在肯尼亞被分離并證明是CCPP病原體[4]。目前報(bào)道來看，其流行區(qū)域主要分布在亞洲、中東和非洲40多個(gè)國(guó)家，但分離到病原的只有16個(gè)國(guó)家[5]。CCPP在我國(guó)歷史悠久，1922年新疆伊犁發(fā)生山羊“爛肺病”，1958年研制成功組織滅活疫苗并較好地控制了本病的流行；但2007年，我國(guó)再次從臨床分離到Mccp[6]，隨后儲(chǔ)岳峰等[7]、郭晗等[8]、劉波等[9]和YU等[10]分別從西北地區(qū)、內(nèi)蒙古和西藏地區(qū)分離到Mccp，表明CCPP在我國(guó)卷土重來并危害到野生羊，不容忽視。

準(zhǔn)確診斷是制定疫病有效防控措施的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，然而，CCPP常與其他呼吸道感染混淆，如由絲狀支原體簇其他部分成員引起的肺炎。盡管有通過超聲波圖像顯示胸部病變特征結(jié)合臨床的診斷報(bào)道[11]，但CCPP臨床癥狀并不具有特征性，確診須實(shí)驗(yàn)室方法，如病原學(xué)診斷、分子生物學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)診斷等。其中，由于Mccp分離培養(yǎng)困難、分離率極低且耗時(shí)長(zhǎng)，雖是經(jīng)典確診CCPP方法，具備分離鑒定Mccp能力的實(shí)驗(yàn)室并不多。因此常用分子方法和血清學(xué)方法進(jìn)行快速檢測(cè)實(shí)現(xiàn)輔助診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及免疫監(jiān)測(cè)等，本實(shí)驗(yàn)室目前正在開展這兩方面的工作[12]，本文對(duì)CCPP常用血清學(xué)抗原抗體診斷方法、Mccp單抗以及診斷靶標(biāo)進(jìn)行總結(jié)，分析其優(yōu)缺點(diǎn)并進(jìn)行展望，以期為下一步研究提供思路。

1 抗原診斷方法

1.1 凝膠沉淀試驗(yàn)(GPT)以Mccp分泌多糖制備的單抗WM25識(shí)別樣品中的Mccp多糖進(jìn)而產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，該單抗也可用與Mccp多糖發(fā)生凝膠沉淀反應(yīng)的山羊康復(fù)血清(含有IgM)代替[13]。這種方法尤其適用于存放時(shí)間過長(zhǎng)或運(yùn)輸不當(dāng)造成變質(zhì)的樣品。但凝膠沉淀試驗(yàn)不夠特異，與絲狀支原體簇其他成員尤其李奇支原體會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)[14]。

1.2 乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)MARCH等[15]開發(fā)了一種識(shí)別Mccp莢膜多糖的LAT，用抗Mccp多克隆血清包被乳膠顆粒，該方法可用于快速檢測(cè)Mccp。檢測(cè)田間血清時(shí)，與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(CFT)相比，一致性為67%；這種方法極大提高了敏感性，最低能檢測(cè)出0.03 mL 血清里2 ng的莢膜多糖(1.7×104CFU)；但是與李奇支原體也存在交叉反應(yīng)。因敏感性高，且檢測(cè)的是病原本身，適用于CCPP的早期診斷。

1.3 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)( GIT)GIT原理是高免血清直接抑制培養(yǎng)基中Mccp生長(zhǎng)。使用多克隆抗血清時(shí)，Mccp與李奇支原體PG50、生殖支原體和類人猿支原體有交叉反應(yīng)。RURANGIRWA等[13]篩選到1株單克隆抗體WM25，基于WM25建立的圓盤生長(zhǎng)抑制法，可以將Mccp與無乳支原體、山羊支原體山羊亞種和絲狀支原體簇中其他山羊支原體區(qū)分開，但不能區(qū)分李奇支原體。RURANGIRWA等[16]又篩選到1株單抗E8-18，但不抑制Mccp體外生長(zhǎng)，因此不能用于GIT。GIT常用于鑒定Mccp培養(yǎng)物。

1.4 免疫熒光試驗(yàn)(FAT)直接和間接FAT對(duì)于鑒定大多數(shù)支原體來說是最有效的血清學(xué)方法。RURANGIRWA等[13]依賴單抗WM25建立一種菌落免疫熒光檢測(cè)方法，雖與山羊支原體山羊亞種有交叉反應(yīng)，但可以區(qū)分李奇支原體，若是結(jié)合WM25生長(zhǎng)抑制法可實(shí)現(xiàn)Mccp的鑒定。但當(dāng)使用兔高免血清時(shí)，對(duì)于Mccp是非特異性的。FAT常用于鑒定Mccp培養(yǎng)物，也可用于組織樣本中Mccp抗原的檢測(cè)。

2 抗體診斷方法

2.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)CFT目前是國(guó)際貿(mào)易指定的CCPP檢疫試驗(yàn)。以Mccp F38菌株超聲后的上清作為抗原[17-18]。大多數(shù)支原體，尤其是屬于絲狀支原體簇的其他支原體，在CFT中會(huì)有交叉反應(yīng)，所以在無CCPP的國(guó)家或地區(qū)發(fā)現(xiàn)CFT陽性時(shí)，應(yīng)該追加其他的檢測(cè)來確定。可疑血清應(yīng)用絲狀支原體簇其他幾種支原體抗原同時(shí)檢測(cè)，尤其是山羊支原體山羊亞種和李奇支原體。CFT在CCPP的血清學(xué)診斷中最為廣泛，缺點(diǎn)是會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，敏感性較低，而且不同實(shí)驗(yàn)室制備的抗原存在差異，一致性不高。

2.2 間接血凝試驗(yàn)(IHA)IHA是最早用于檢測(cè)Mccp抗體的血清學(xué)方法之一，在無乳支原體和牛生殖道支原體檢測(cè)中也有應(yīng)用，其抗原穩(wěn)定性可以保持7個(gè)月[19]。IHA是目前我國(guó)獲得新獸藥證書的CCPP抗體檢測(cè)方法，也是CCPP新滅活疫苗的替代檢驗(yàn)方法。我國(guó)建立的IHA方法以Mccp分泌多糖為抗原致敏綿羊紅細(xì)胞為基礎(chǔ)，用絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、溶血性曼氏桿菌及豬肺炎支原體的陽性血清對(duì)該方法進(jìn)行特異性評(píng)估，結(jié)果均為陰性，顯示出較好的特異性[20]。間接血凝方法靈敏度、特異性較高，方法簡(jiǎn)單、快速，可用于Mccp的血清學(xué)診斷及流行病學(xué)調(diào)查，凍干抗原可保存5年以上。但由于載體紅細(xì)胞可能因供體個(gè)體及制備批次的差異，對(duì)其批次穩(wěn)定性有一定影響。潛在的問題還包括用Mccp多糖抗原作為診斷靶標(biāo)可能存在特異性不足，根據(jù)BERTIN等[21]對(duì)絲狀支原體簇成員多糖編碼基因及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析，Mccp多糖檢測(cè)抗體或可能與李奇支原體和山羊支原體山羊亞種發(fā)生交叉反應(yīng)，不同菌株間也可能有一定的差別。

2.3 乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)通過Mccp模式菌株F38產(chǎn)生的多糖致敏乳膠顆粒，若血液中有Mccp抗體，則會(huì)發(fā)生血凝現(xiàn)象[22-23]。經(jīng)驗(yàn)證，多糖致敏的乳膠顆粒與絲狀支原體絲狀亞種大菌落型、絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊亞種、精氨酸支原體和結(jié)膜支原體血清反應(yīng)結(jié)果均為陰性，表現(xiàn)出了良好的種特異性。而且LAT比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和CFT都易于操作[23]：只需1滴全血，在玻片上就可以進(jìn)行，結(jié)果肉眼可見，檢測(cè)成本較低。但是，產(chǎn)生與Mccp多糖相似的其他支原體(如李奇支原體)或是某些細(xì)菌都可能發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.4 ELISA試驗(yàn)1994年， THIAUCOURT等[24]建立了1種阻斷酶聯(lián)免疫方法(B-ELISA)，由Mccp模式菌株F38得到的單克隆抗體4.52作為阻斷抗體，但敏感性不高。法國(guó)國(guó)際研發(fā)農(nóng)業(yè)研究中心(CIRAD)基于這種B-ELISA改善成1種C-ELISA[25]，具有高度的特異性(99.8%～100.0%)[26]。通過一項(xiàng)國(guó)際合作研究，確認(rèn)了該C-ELISA方法在非洲、亞洲以及中東國(guó)家應(yīng)用效果[5]，該方法目前已開發(fā)成商業(yè)化試劑盒。WANBUGU等[27]于2005年開發(fā)了一種I-ELISA，利用一種特異的Mccp莢膜多糖表位作為包被抗原，比基于相似抗原的LAT有更好的診斷效果。已有報(bào)道對(duì)LAT、I-ELISA和C-ELISA進(jìn)行了對(duì)比評(píng)估，共325例樣品，LAT檢測(cè)出53份陽性，I-ELISA檢測(cè)出64份陽性，C-ELISA檢測(cè)出38份陽性[28]。以這些結(jié)果來看，LAT和ELSIA都可以用于常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)，LAT適用于田間檢測(cè)，其敏感性與特異性和ELISA相當(dāng)；然而，就實(shí)驗(yàn)室診斷來說，ELISA相比于其他的方法來說具有更好的敏感性或特異性。

ELISA可用于監(jiān)測(cè)畜群狀態(tài)、疫苗免疫水平、病例確診以及流行病學(xué)調(diào)查。但在急性病程中，血清學(xué)還未反應(yīng)出抗體的變化，宿主就已經(jīng)死亡，所以說其更適用于群體而非個(gè)體的診斷?；趩慰沟腃-ELISA與CFT相比，其敏感性較高、特異性強(qiáng)，可避免同絲狀支原體簇的其他支原體發(fā)生交叉反應(yīng)；其次，C-ELISA也可用來評(píng)價(jià)CCPP疫苗的質(zhì)量，但其滴度和保護(hù)之間的關(guān)系還不明確[5]。實(shí)際上，因?yàn)樯婕暗匠杀?，C-ELISA并未被廣泛使用[29]。

3 單抗

由于Mccp屬于絲狀支原體簇成員之一，成員間存在高度的抗原及遺傳相似性，因此CCPP的診斷方法要求較高的特異性，單抗是最佳選擇之一。國(guó)外已報(bào)道針對(duì)Mccp的單抗包括WM25[13,30]、E8-18[16]和4.52[5,24]。其中，基于WM25建立生長(zhǎng)抑制法和菌落免疫熒光法，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中與李奇支原體存在交叉反應(yīng)，菌落免疫熒光試驗(yàn)與山羊支原體山羊亞種交叉反應(yīng)，但可將兩者結(jié)合起來對(duì)Mccp進(jìn)行鑒定?；趩慰?.52建立的C-ELISA方法，已被IDEXX開發(fā)成商品化試劑盒，具有較高的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。單抗E8-18雖然能識(shí)別Mccp上特有的膜蛋白P24，但其不具有生長(zhǎng)抑制特性；而基于E8-18建立的阻斷ELISA結(jié)果顯示試驗(yàn)感染的山羊血清不能阻斷單抗與Mccp抗原結(jié)合。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期也篩選到5株單抗，但與綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種PG3和牛支原體08M存在不同程度的交叉反應(yīng)[31]。

4 特異性抗原靶標(biāo)篩選

決定免疫學(xué)診斷方法特異性和敏感性的另一關(guān)鍵是抗原靶標(biāo)。隨著基因組測(cè)序的快速發(fā)展，部分Mccp菌株的完整基因組序列已被解析。CHEN等[32]對(duì)M1601進(jìn)行了全基因組分析，其基因組大小為1 016 707 bp，GC含量為23.67%，編碼915個(gè)基因，其中713個(gè)蛋白編碼基因，包括26個(gè)潛在毒力因子，表明可能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，作為潛在的血清學(xué)診斷靶標(biāo)。最近，LI等[33]對(duì)Mccp不同分離株及絲狀支原體簇成員之間進(jìn)行比較基因組分析，得到183個(gè)Mccp區(qū)別于其他山羊源支原體的特異性基因，以及一些與宿主特異性有關(guān)的毒力因子，但文章中并未提供相關(guān)基因和毒力因子的完整信息。

從蛋白水平上進(jìn)行靶標(biāo)篩選也進(jìn)行了一定的工作，MARCH等[34]報(bào)道的IgG免疫印跡試驗(yàn)中，試驗(yàn)感染血清和25份田間血清均在44 000，40 000和23 000處出現(xiàn)條帶。大多數(shù)血清中觀察到108 000，70 000和62 000條帶。這些“核心”免疫顯性蛋白(在陰性血清中未能識(shí)別)可能是表達(dá)重組蛋白作為篩選診斷靶標(biāo)的基礎(chǔ)。CHRUCHWARD等[35]通過2D電泳質(zhì)譜分析以及Western blot比較蛋白組學(xué)方法得到絲狀支原體山羊亞種6個(gè)候選診斷蛋白，這些蛋白包括丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸甘氨酸激酶、吡啶-核苷磷酸酶、30S核糖體蛋白S6和二磷酸三乙酯和酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶。另外本實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)Mccp GH2株外膜蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量大約為60 000 和49 700的蛋白可能是其區(qū)別于絲狀支原體山羊亞種PG3株和綿羊肺炎支原體Y98株的主要特異性抗原[36]。

5 討 論

目前免疫學(xué)檢測(cè)除了上述常用的方法外，還報(bào)道了反向血凝實(shí)驗(yàn)(PHT)[37]、玻片凝集試驗(yàn)(SAT)[38]和交叉免疫電泳(CIE)[39]。然而，目前已有的免疫學(xué)檢測(cè)方法存在包括非特異性、實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備要求成本高和不易操作等缺點(diǎn)，給CCPP的診斷造成了困難。

已知全世界范圍內(nèi)超過40個(gè)國(guó)家受到Mccp影響，對(duì)全世界的養(yǎng)羊業(yè)都是一個(gè)威脅，血清學(xué)抗體檢測(cè)能較好地反應(yīng)宿主感染狀態(tài)或免疫狀態(tài)，因此是CCPP防控不可或缺的技術(shù)環(huán)節(jié)。鑒于目前CCPP抗體檢測(cè)方法存在的問題，期望篩選出更特異的診斷靶標(biāo)，進(jìn)而從田間實(shí)用性以及成本方面考慮，建立實(shí)用、低成本或高通量的血清學(xué)抗體診斷方法。目前，本實(shí)驗(yàn)室采用比較基因組、比較蛋白組學(xué)和單抗篩選等方法，在診斷靶標(biāo)篩選方面進(jìn)行了一些探索，如用Mccp1601菌株的全基因組蛋白編碼序列與絲狀支原體簇內(nèi)的其他支原體基因組序列進(jìn)行比較，得到了部分Mccp1601特異性地蛋白編碼基因序列，下一步將從這些編碼序列中篩選出Mccp共有的蛋白作為潛在抗原靶標(biāo)進(jìn)行鑒定；同時(shí)，以Mccp菌體蛋白及其膜蛋白做二維電泳，用Mccp及絲狀支原體簇成員的免疫血清進(jìn)行免疫印跡篩選差異免疫原；另外，用常見反芻動(dòng)物支原體菌株抗原反向篩選Mccp單抗等，以期通過上述工作能夠篩選鑒定到Mccp特異性診斷靶標(biāo)，繼而建立Mccp抗體的快速或高通量檢測(cè)技術(shù)，為CCPP防控提供可靠的技術(shù)手段。