豬δ冠狀病毒基因組學(xué)及診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張 森，楊 偉，湯德元，曾智勇，黃 濤，王 彬， 石遠(yuǎn)菊，葉 麗，郭倩妤，廖少山

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種能夠引起豬嚴(yán)重腹瀉、脫水的腸道病毒[1]。PDCoV屬于冠狀病毒科，δ冠狀病毒屬的單股正鏈RNA病毒。PDCoV于2012年在中國香港被首次發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)在其他國家被發(fā)現(xiàn)，目前，韓國、美國、中國、日本、老撾、加拿大、越南等國已有報(bào)道，我國大部分地區(qū)均有檢出，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[2-5]。感染PDCoV后發(fā)生的主要臨床癥狀與感染豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬流行性腹瀉(PED)、豬輪狀病毒病(PoRV)癥狀相似且臨床上難以區(qū)別，都能引起腹瀉、脫水、嘔吐，最終導(dǎo)致死亡[6]。PDCoV一般感染豬消化道，通過糞便排出，偶爾也可以通過呼吸道進(jìn)行傳播。本文主要通過對PDCoV的病原學(xué)特征、臨床癥狀、診斷技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為獸醫(yī)工作者及科研工作者對該病的研究及診斷提供理論參考。

1 病毒基因組結(jié)構(gòu)

PDCoV是單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，病毒顆粒呈球形或多型性，病毒直徑約為100 nm，與其他冠狀病毒類似，有囊膜和許多末端凸起的纖突，PDCoV基因組大小為25.4 kb，是目前發(fā)現(xiàn)的基因組中最小的冠狀病毒成員[7-8]。PDCoV有5′帽子結(jié)構(gòu)/3′poly A尾和8個(gè)開放閱讀框(ORFs)，病毒基因組依次包括：5′非翻譯區(qū)(UTR)、開放閱讀框1a/1b(ORF1a/1b)、纖突蛋白基因片段(S)、包膜蛋白基因片段(E)、膜蛋白基因片段(M)、非結(jié)構(gòu)蛋白6(NS6)、核衣殼蛋白基因片段(N)、非結(jié)構(gòu)蛋白7(NS7)和3′非翻譯區(qū)(UTR)[4]。MARTHALER等[9]將美國的幾株P(guān)DCoV病毒進(jìn)行基因測序后與中國PDCoV病毒測序進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E區(qū)片段最保守，相似度為99.6%；S區(qū)片段差異性最大，相似度為98.5%～98.8%。目前對冠狀病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的一般特征及其在病毒復(fù)制中的作用已經(jīng)明確，但PDCoV的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白在感染宿主細(xì)胞的詳細(xì)功能和作用目前還沒有完全破解。近期LEE等[10]研究表明PDCoV 的N蛋白參與PDCoV感染的早期階段通過上調(diào)宿主細(xì)胞的熱休克蛋白70(HSP70)的2個(gè)伴侶蛋白GRP78及HSC70來抑制宿主細(xì)胞凋亡，且N蛋白可與EF1α相互作用完成病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，這一點(diǎn)與其他冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞的機(jī)理相似。

2 臨床癥狀

PDCoV的臨床癥狀為食欲減退、急性水樣腹瀉、輕度或中度嘔吐、脫水、嗜睡等，仔豬偶爾會(huì)因?yàn)槊撍鴮?dǎo)致死亡，病死率為30%～40%，成年豬發(fā)病后會(huì)自行恢復(fù)、死亡率低，常呈一過式反應(yīng)[6]。JUNG等[11]將2株P(guān)DCoV(OH-FD22和OH-FD-100)分別感染7只SPF豬，接種后21～120 h，所有豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、十二指腸至結(jié)腸腸壁變薄，且腸腔中有大量黃色液體，病理結(jié)果顯示存在嚴(yán)重的萎縮性腸炎，盲腸和結(jié)腸中淺表上皮細(xì)胞的輕度空泡化且發(fā)生腹瀉48 h后即可從糞便中檢出病毒。被PDCoV感染后的豬會(huì)經(jīng)常受到TGEV、PEDV、PoRV等病毒的混合感染。MARTHALER等[9]對美國的TGE、PED、PoRV發(fā)病豬進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)患有以上疾病的豬糞便中大多可以檢測到PDCoV，表明PDCoV常與其他引起腹瀉的病毒混合感染。一旦出現(xiàn)混合感染的情況，死亡率極高，有時(shí)可達(dá)到80%以上[12]。該病毒同時(shí)也會(huì)感染鳥類和哺乳動(dòng)物，JUNG等[13]將PDCoV病毒OH-FD22株以口服的方式感染3～7歲的小牛，接種3 d后從糞便中檢查到病毒RNA以及在血液中檢測到PDCoV特異性血清IgG抗體，但沒有引起腹瀉等臨床癥狀。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

由于豬δ冠狀病毒病的臨床癥狀與TGE、PED、PoRV極為相似，導(dǎo)致通過簡單的觀察臨床癥狀及病理變化無法得出結(jié)論，所以對PDCoV的實(shí)驗(yàn)室臨床診斷方法的研究就十分重要。目前對PDCoV實(shí)驗(yàn)室診斷方法有PDCoV病毒的分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、mRT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等。

3.1 病毒的分離培養(yǎng)PDCoV 病毒的分離培養(yǎng)可以采用豬睪丸細(xì)胞系(ST)和豬腎細(xì)胞系(LLC-PK)等作為宿主細(xì)胞感染。劉寶京等[14]將河北養(yǎng)殖場采集的PDCoV 病毒樣品感染ST細(xì)胞并觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)ST細(xì)胞在感染后12～24 h出現(xiàn)CPE，且細(xì)胞明顯變大、變圓，最后脫落，提取該細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR檢測顯示擴(kuò)增條帶與目的條帶相符，測序結(jié)果與其他PDCoV 毒株相近，說明成功分離出1株P(guān)DCoV 病毒。美國HU等[15]將帶有PDCoV 病毒的腹瀉樣品接種于LLC-PK 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后通過RT-qPCR等方法證明成功分離出PDCoV 病毒，并命名為OH-FD22。

3.2 ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是根據(jù)抗原與抗體結(jié)合原理來對PDCoV 進(jìn)行診斷，該方法特異性強(qiáng)、敏感度高、使用簡單方便、結(jié)果準(zhǔn)確，是目前最常用的檢測抗原或抗體的方法之一。ELISA技術(shù)是目前用于檢測PDCoV發(fā)展最快的血清學(xué)方法。

THACHIL等[16]開發(fā)了基于PDCoV纖突蛋白(S)的S1部分的抗 IgG間接ELISA試劑盒，并將其用于調(diào)查美國豬中PDCoV的流行情況，是全世界首個(gè)檢測PDCoV的ELISA方法。SU等[17]利用組氨酸標(biāo)記的重組核衣殼(N)蛋白作為抗原來檢測針對PDCoV的抗體，建立了間接ELISA方法,靈敏度可達(dá)90%以上，且特異性強(qiáng)，其N蛋白基本不與PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PCV-2、PRV和PRRSV發(fā)生血清交叉反應(yīng)。利用該方法對黑龍江省319份血清樣品進(jìn)行檢測，調(diào)查結(jié)果表明，在沒有腹瀉的豬場中，有3.33%的樣本(7/210)PDCoV呈陽性；發(fā)生腹瀉的農(nóng)場，有27.52%的樣品(30/109)PDCoV呈陽性，說明在黑龍江省由于感染PDCoV而引發(fā)腹瀉的可能性很高。OKDA等[18]將N蛋白進(jìn)行重折疊建立了間接ELISA，與未重折疊N蛋白建立的間接ELISA方法相比，特異性更強(qiáng)、靈敏度更高。LUO等[19]開發(fā)了一種基于重組膜蛋白(M)的ELISA，該方法和以N蛋白建立的間接ELISA方法相比與PEDV的交叉反應(yīng)更弱，效果更好。

3.3 RT-PCRRT-PCR方法是目前最常用的分子生物學(xué)診斷方法之一,其具有操作簡單、反應(yīng)速度快、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)普遍運(yùn)用。近年來研究人員建立了多種RT-PCR方法檢測PDCoV，WANG等[20]利用HKU15-155 毒株的M 67F基因片段和N 41F基因片段的保守區(qū)分別設(shè)計(jì)了2組RT-PCR引物，建立了診斷美國PDCoV 的一步法RT-PCR 診斷方法。SONG等[21]建立了巢式RT-PCR 診斷方法用于檢測31份豬腹瀉樣品，成功檢測出9個(gè)顯示出預(yù)期片段的RT-PCR產(chǎn)物。韋學(xué)雷等[22]建立了PDCoV、TGEV和PE-DV多重RT-PCR 檢測方法，該方法相對于單一RT-PCR方法特異性好、靈敏度高、可以同時(shí)檢測多種病毒，可用于臨床仔豬腹瀉的快速檢測診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。楊艷楠[23]建立了豬4種冠狀病毒的多重RT-PCR檢測方法，可以同時(shí)檢測PDCoV、TGEV和PEDV、豬血凝性腦脊髓炎病毒(P-HEV)，豐富了豬冠狀病毒診斷方法。

3.4 Real-time RT-PCR目前已經(jīng)開發(fā)出許多用于檢測PDCoV 的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法。qPCR與普通PCR相比，不但可以實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA擴(kuò)增的量，而且具有更高的靈敏度和特異性。MA等[24]利用PDCoV的N基因保守片段同時(shí)構(gòu)建了普通RT-PCR和以SYBR Green為染料的RT-qPCR，對比結(jié)果顯示普通RT-PCR與RT-qPCR相比，特異性相似、但靈敏度RT-qPCR更勝一籌。HUANG等[25]建立了基于TaqMan探針的多重實(shí)時(shí)RT-qPCR，同時(shí)檢測4種豬腸道冠狀病毒，可以同時(shí)檢測傳染性TGEV、PEDV、豬腸道致病阿爾法冠狀病毒(PEAV)和PDCoV，且該方法能檢測到10～100個(gè)拷貝的4種病毒的基因組。MASUDA等[26]建立了可以同時(shí)檢測PEDV，TGEV、PDCoV和PoRVA的四重RT-qPCR，豐富了該方法對豬腹瀉癥狀檢測的診斷，且后3種病毒均達(dá)到了10個(gè)拷貝的靈敏度。

3.5 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)LAMP可以在等溫條件下以高靈敏度和特異性擴(kuò)增核酸，這種新型基因檢測技術(shù)具有較高的成本效益且可以節(jié)省時(shí)間，為快速準(zhǔn)確地鑒定病毒等其他病原體提供了潛在的有效工具。ZHANG等[27]建立了用于視覺檢測PDCoV的特異性和靈敏的RT-LAMP測定方法，該方法針對PDCoV N基因的保守編碼區(qū)設(shè)計(jì)了1組引物，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，使靈敏度達(dá)到了10個(gè)拷貝，比傳統(tǒng)的RT-PCR靈敏100倍，核酸擴(kuò)增時(shí)間可以縮短至70 min，該方法可以快速、特異、靈敏的檢測PDCoV。

3.6 恒溫?zé)岣艚^式PCR(iiPCR)iiPCR是一種病毒的快速診斷方法，該方法原理與PCR技術(shù)相似，但相比于PCR技術(shù)具有使用方便、反應(yīng)時(shí)間快、可現(xiàn)場診斷等特點(diǎn)，目前已經(jīng)開發(fā)出將探針嵌入核酸中或利用染料進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測的方法，不但降低了檢測成本，且有快速現(xiàn)場診斷的潛力，具有良好的發(fā)展前景[28]。ZHANG等[29]建立了用于診斷PDCoV 的 RT-iiPCR 診斷方法，并與PDCoV RT-qPCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，該方法的靈敏度高且特異性和準(zhǔn)確度均達(dá)到了100%，說明該方法可靠，可用于未來的臨床診斷中。

3.7 重組酶聚合酶擴(kuò)增法(RPA)RPA是一種可以用于病毒檢測的等溫?cái)U(kuò)增方法，通常在25～43℃的條件下5～20 min即可觀察結(jié)果，具有操作簡單、成本低廉、診斷迅速等特點(diǎn)，是一種被認(rèn)為未來可以替代PCR的診斷方法，已廣泛用于病毒檢測。MA等[30]以PDCoV 的N基因保守區(qū)制備PDCoV備體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，成功建立了PDCoV 的RT-RPA診斷方法，該方法與RT-qPCR相比具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：裝置便攜；運(yùn)行時(shí)間短(僅需要<30 min)；在1個(gè)操作管中使用酶，簡化了操作程序并減少污染的可能性;未來可用于實(shí)驗(yàn)室外的診斷。

4 展望

PDCoV是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種引起豬腸道癥狀的病毒，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失，嚴(yán)重的影響了全國乃至世界的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。目前對該病毒的致病機(jī)制、診斷方法和疫苗的研究正在不斷發(fā)展。由于該病毒與豬其他引起腸道癥狀病毒發(fā)病癥狀相似，在臨床上難以辨別，故對本病混合感染診斷方法及即時(shí)診斷方法的建立就顯得尤為重要。目前，對該病毒還沒有開發(fā)出相應(yīng)的疫苗，相信不久的將來，用于該病毒免疫的疫苗會(huì)成功研發(fā)。