人類血小板抗體在不同年齡性別兒童免疫性血小板減少癥中的表達(dá)及其治療中的意義

張劉仟，朱從奎，尤建國，顧小文

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)為兒童常見臨床出血性疾病，在兒童出血性疾病中占1/4，以血小板數(shù)量減少、束臂試驗陽性、皮膚黏膜自發(fā)性出血、延長出血時間和血塊收縮不良為主要臨床表現(xiàn)。ITP為一種自限性疾病，以維持血小板數(shù)量處于安全水平為主要治療目的，主要為避免嚴(yán)重出血的發(fā)生。有學(xué)者報道，血小板計數(shù)≤30×109/L為界為初始指征是可行的，首先進行觀察再治療并不會對早期療效減弱，也不會使嚴(yán)重臟器出血等情況出現(xiàn)[1]。研究還報道，ITP患者與健康兒童比較其體內(nèi)血小板抗體水平呈明顯升高趨勢，具有一定ITP臨床診斷價值[2]。目前對于血小板抗體增高程度和其在ITP患者治療的臨床意義尚未發(fā)現(xiàn)較多報道，基于此，本研究病歷匯總了人類血小板抗體(human platelet antibody，HPA)與治療短期有效率之間的這個方面，主要對HPA陽性率、不同性別、年齡與ITP短期有效率關(guān)系進行了分析探討?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院2019年1-8月確診的60例原發(fā)性ITP并行HPA檢測的患者作為研究對象，其中男34例，女26例；年齡1個月～12歲。根據(jù)年齡的不同分為<3歲組和≥3歲組(不超過18歲)；根據(jù)HPA值的不同分為1∶10組、<1∶10組[HPA(-)組]和>1∶10組[HPA(+)組]，其中，1∶10組30例、<1∶10組22例、>1∶10組8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：ITP患者符合2013年兒童ITP疾病診治建議[3]：(1)正常血細(xì)胞形態(tài)，血小板計數(shù)<100×109/L；(2)皮膚出現(xiàn)瘀斑、出血點或臟器出血和黏膜等情況；(3)一般脾臟無增大；(4)骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)正?；蛟黾?，有成熟障礙；(5)本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或家屬均自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)系統(tǒng)性紅斑狼瘡者；(2)其他自身免疫性疾病者；(3)遺傳性血小板減少癥或以血小板計數(shù)減少為首發(fā)表現(xiàn)的再生障礙性貧血者；(4)低增生性白血病者。

1.2 儀器和方法 (1)儀器：取德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司生產(chǎn)的抗血小板抗體檢測試劑盒和加樣板，采用間接免疫熒光法。試劑盒成分包括陰性對照、陽性對照、生物載片、pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液、蓋玻片、封片介質(zhì)、吐溫20和羊抗人IgG(異硫氰酸熒光素標(biāo)記)。其中陰性對照為自身抗體陰性(人源)，陽性對照為抗血小板抗體IgG陽性(人源)。(2)方法：包括制備血小板懸液、標(biāo)記血小板抗體和顯微鏡下觀察熒光強度。首先取患者1.2～2.0 ml乙二胺四乙酸抗凝血，以800 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min，之后將富血小板血漿分離，磷酸鹽緩沖液、吐溫緩沖液按1∶10稀釋血漿 。然后加樣板反應(yīng)區(qū)中加入稀釋30 μl血漿，用加樣板凹槽蓋入載片覆有生物膜的一面，于18～25 ℃下溫育(過程中清潔加樣板反應(yīng)區(qū)需滴加25 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白)，時間為30 min，需避光處理，之后將反應(yīng)膜片進行沖洗(磷酸鹽緩沖液、吐溫緩沖液)，需5 min浸泡時間，載片水分用吸水紙吸干，然后充分接觸二抗所在反應(yīng)區(qū)，溫育30 min，需避光并5 min浸泡處理，將蓋玻片和封片介質(zhì)備好，載片水分用吸水紙吸干，蓋玻片嵌入載片。最后顯微鏡下觀察熒光強度，比較陰性和陽性對照結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)與評價標(biāo)準(zhǔn) 分析HPA和年齡、性別及治療的短期有效率之間的關(guān)系。短期有效率[4]按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分完全反應(yīng)、有效、激素依賴和無效。完全反應(yīng)為無出血，治療后血小板計數(shù)≥100×109/L；有效為無出血，治療后血小板計數(shù)≥30×109/L，增加2倍基礎(chǔ)血小板計數(shù)；激素依賴為避免出血，皮質(zhì)激素連續(xù)使用使血小板計數(shù)≥30×109/L；無效為有出血，治療后血小板計數(shù)<30×109/L或無法增加2倍基礎(chǔ)血小板計數(shù)。ITP療效判斷需行2次檢測，2次間隔7 d及以上。將療效分為有效組和無效組，激素依賴和無效為無效組，完全反應(yīng)和有效為有效組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件包處理。符合正態(tài)分布的計數(shù)資料采用率或百分比進行描述，采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者一般情況和不同年齡組的男女比 60例原發(fā)性ITP并行HPA檢測的患者中男34例(56.67%)，女26例(43.33%)，男女比為1.31∶1.0；年齡1個月～12歲。HPA檢測患者中不同年齡階段的性別比例明顯不同(P<0.05)， <3歲組男性占多數(shù)，≥3歲組女性占多數(shù)。見表1。

表1 ITP患者一般情況和不同年齡組的男女比

注：ITP為免疫性血小板減少癥。與<3歲組比較χ2=0.003，aP<0.05

2.2 ITP患者不同性別HPA陽性率比較 不同性別HPA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITP患者不同性別HPA陽性率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥,HPA為人類血小板抗體

2.3 ITP患者不同年齡HPA陽性率比較 <3歲組HPA陽性率高于≥3歲組(P<0.05)。見表3。

表3 ITP患者不同年齡HPA陽性率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥，HPA為人類血小板抗體。與<3歲組比較aP<0.05

2.4 ITP患者不同HPA組短期有效率比較 HPA<1∶10組、1∶10組和>1∶10組ITP患者短期有效率分別為90.00%、90.90%和100.00%。HPA>1∶10組短期有效率高于HPA<1∶10組和1∶10組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但HPA<1∶10組和1∶10組ITP患者短期有效率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 ITP患者不同HPA組短期有效率比較

注：ITP為免疫性血小板減少癥,HPA為人類血小板抗體。與HPA>1∶10組比較aP<0.05

3 討論

當(dāng)機體免疫功能出現(xiàn)紊亂時，可直接破壞血小板導(dǎo)致血小板數(shù)量減少，也可以通過抑制骨髓巨核細(xì)胞的分化，降低血小板的生成，ITP為部分自限性出血性疾病和自身免疫性疾病。大多數(shù)認(rèn)為血小板生成減少和血小板破壞增加為導(dǎo)致ITP血小板生成減少的主要因素。目前研究發(fā)現(xiàn)，免疫反應(yīng)異常、感染和遺傳易感性為ITP主要發(fā)生機制[5]。免疫反應(yīng)異常表現(xiàn)在自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能異常、細(xì)胞因子和血小板抗體產(chǎn)生異常。之前有研究報道過ITP受感染后體內(nèi)會有交叉反應(yīng)性抗血小板自身抗體產(chǎn)生，但尚不完全明確其發(fā)生機制[6]。感染作為ITP主要發(fā)生機制之一，可致機體抗血小板克隆抗體被感染病原體的交叉抗原反應(yīng)激活，從而破壞血小板，目前也有免疫接種和手足口病等均可使患兒體內(nèi)減少血小板數(shù)量的相關(guān)報道。遺傳因素對患兒體內(nèi)免疫功能異常的研究尚未見相關(guān)報道。研究發(fā)現(xiàn)，ITP與自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征和普通多變型免疫缺陷病密切相關(guān)[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者體內(nèi)血小板抗體在一定程度上可影響血小板功能[8]。

本研究結(jié)果顯示，ITP患者<3歲組男童占多數(shù)，其發(fā)病率也更高，其中<3歲組和≥3歲組男女比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者男童占多數(shù)，<3歲組男童比例更高[9]。這也與學(xué)者研究報道符合[10]。盡管如此，但本研究中，不同性別的ITP患兒HPA陽性率比較無明顯差異，說明盡管男性兒童的ITP發(fā)生率高，但不影響HPA的陽性率。同時，本研究中對于年齡<3歲組HPA陽性率明顯高于≥3歲組，分析原因，<3歲兒童的自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠完善，受外來因素影響時更加容易出現(xiàn)免疫功能紊亂的情況，因而年齡<3歲的ITP患兒HPA陽性率明顯高于≥3歲兒童[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)，HPA<1∶10組和1∶10組ITP患者短期有效率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但HPA>1∶10組短期有效率高于HPA<1∶10組和1∶10組，接近100%。說明HPA陽性率高的患兒給予治療方案治療會產(chǎn)生更好的效果和反應(yīng)。這與相關(guān)研究結(jié)論存在不同，可能與抗體組成和抗體檢測方式有關(guān)。目前一致認(rèn)為，免疫異常明顯的患兒其接受治療方式更有效果，對于免疫應(yīng)答較弱的患兒可從遺傳治療、基因治療等方面進行靶向藥物治療。

目前ITP患者主要治療方式包括免疫球蛋白靜脈注射、糖皮質(zhì)激素大劑量沖擊療法、脾切除或服用血小板生成素等，加上抗感染治療等對癥治療和基礎(chǔ)治療，這些治療方式對免疫應(yīng)答較明顯的患兒進行了實際驗證。許多專家認(rèn)為，遺傳治療和基因治療為前沿靶向治療，可作為研究的重點和熱點。希望將來有更好的治療方式惠及ITP患者。

綜上所述，ITP患者<3歲組男性占多數(shù)，其HPA陽性率更高。同時HPA檢測在一定程度上能指導(dǎo)ITP診斷，HPA>1∶10組在臨床上短期有效率更高。