殼聚糖-檸檬酸/聚丙烯酰胺雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的構(gòu)筑與性能研究

劉瑞雪　李迎博　李義夢(mèng)　周騰

摘要：以殼聚糖（CS）、檸檬酸（CA）、丙烯酰胺（AAm）為原料，采用兩步法制備殼聚糖-檸檬酸/聚丙酰胺（CS＼|CA/PAAm）雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，并對(duì)不同PAAm含量下其流變性能、力學(xué)性能、微觀形貌等進(jìn)行分析與表征.結(jié)果表明：當(dāng)PAAm含量為34.6%時(shí)，該凝膠的儲(chǔ)能模量最大，為50kPa，由脆性凝膠變?yōu)閿嗔焉扉L(zhǎng)率高達(dá)110%、壓縮形變能力為90%的柔韌性凝膠，且在應(yīng)變?yōu)?0%的條件下循環(huán)壓縮3次而幾乎沒有滯后圈，表現(xiàn)出良好的流變性能和力學(xué)性能.該水凝膠具有更加致密多孔的微觀結(jié)構(gòu)，隨著PAAm的引入（0～34.6%），水凝膠的溶脹率從644%降低到84%，溶脹平衡時(shí)間由54h縮短至25h，且溶血率均小于5%，符合國標(biāo)要求，安全性良好.

Abstract：Usingchitosan（CS），citrate（CA），andacrylamide（AAm）asrawmaterials，atwo＼|stepmethodwasusedtopreparethechitosan＼|citrate/polyacrylamide（CS＼|CA/PAAm）double＼|networkhydrogel，andtherheologicalproperties，mechanicalpropertiesandmicro＼|morphologyofthehydrogelwithdifferentPAAmcontentswereanalyzedandcharacterized.TheresultsshowedthatwhenthePAAmcontentwas34.6%，thestoragemodulusofthehydrogelwasupto50kPa，andthebrittlehydrogelbecameaflexiblehydrogelwithanelongationatbreakofupto110%andacompressivedeformationcapacityof90%.Andundertheconditionof60%strain，therewerealmostnohysteresisloopsaftercycliccompression3times，showinggoodrheologicalandmechanicalproperties.Thehydrogelhadamoredenseandporousmicrostructure.WiththeintroductionofPAAm（0～34.6%），theswellingrateofthehydrogelwasreducedfrom644%to84%，andtheswellingequilibriumtimewasshortenedfrom54hto25h.Thehemolysisratewaslessthan5%，whichmetthenationalstandardrequirementsandhadgoodsafety.

關(guān)鍵詞：殼聚糖;雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠;流變性能;力學(xué)性能;抗溶血

Keywords：chitosan;double＼|networkhydrogel;rheologicalproperty;mechanicalproperty;anti＼|hemolytic

0引言

水凝膠作為一種富含水且具有三維孔洞結(jié)構(gòu)的聚合物軟材料，具有某些與生物組織相似的性質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于生物組織工程等領(lǐng)域[1-2].殼聚糖（CS）是一類多糖，由β-（1-4）-2-氨基-脫氧-β-D-葡聚糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成，具有親水性、抗菌性、

無毒性和良好的生物相容性，常用于制備生物醫(yī)學(xué)材料[3].CS基水凝膠作為一種潛在的仿生物材料，因其具有與生物組織相似的特性，有望應(yīng)用于隱形眼鏡[4]、傷口敷料[5]、組織工程[6]等領(lǐng)域而被廣泛關(guān)注.Z.Shariatinia等[7]系統(tǒng)地討論了CS基水凝膠的合成方法及其應(yīng)用，特別是對(duì)CS基水凝膠在組織工程、藥物緩釋、傷口敷料中的應(yīng)用做了詳細(xì)闡述.J.Li等[8]制備了較為復(fù)雜的納米纖維結(jié)構(gòu)的CS，并使其與聚（丙烯酸-丙烯酰胺）的聚電解質(zhì)鏈形成動(dòng)態(tài)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，用該方法制備的凝膠拉伸強(qiáng)度達(dá)120kPa.E.S.Dragan等[9]制備了一種CS/聚丙烯酰胺（PAAm）互穿網(wǎng)絡(luò)的水凝膠，但是該水凝膠的制備過程對(duì)體系pH值和溫度的要求較高.M.Zeng等[10]使用兩步連續(xù)自由基聚合的方法也制備過CS/PAAm互穿網(wǎng)絡(luò)的水凝膠，其方法是，首先將CS在60℃條件下接枝丙烯酸，發(fā)生自由基聚合反應(yīng)形成第一網(wǎng)絡(luò)，隨后用第一網(wǎng)絡(luò)浸泡丙烯酰胺（AAm）溶液，再次經(jīng)自由基聚合反應(yīng)形成機(jī)械性能顯著提高的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠.受此啟發(fā)，可采用經(jīng)典的兩步法[11]制備雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，并且設(shè)想在第一網(wǎng)絡(luò)中采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽/

N-羥基丁二酰亞胺

，即EDC/NHS催化方法[12]活化體系中的羧基與氨基，進(jìn)而制備生物相容性更好的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠.

本文擬以檸檬酸（CA）為交聯(lián)劑，EDC/NHS為催化劑，于室溫下制備性能可調(diào)的CS第一網(wǎng)絡(luò)，然后用CS第一網(wǎng)絡(luò)浸泡AAm溶液，經(jīng)自由基聚合反應(yīng)引入PAAm的柔性鏈，從而獲得性能可調(diào)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠CS＼|CA/PAAm，并對(duì)該水凝膠的流變性能、力學(xué)性能、溶脹性能、溶血性能等進(jìn)行研究，以期拓寬CS＼|CA/PAAm在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用范圍.

1材料與方法

1.1試劑與儀器

主要試劑：CS，無水檸檬酸，NHS，EDC，過硫酸銨（APS），N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA），阿拉丁試劑上海股份有限公司產(chǎn);AAm，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.抗凝兔血，武漢純度生物科技有限公司產(chǎn).

主要儀器：DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn);DZF-6030型真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn);AK-1140型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn);HAKEMARSⅢ型哈克旋轉(zhuǎn)流變儀，美國ThemoFisher公司產(chǎn);HY型微機(jī)控制萬能材料試驗(yàn)機(jī)，深圳三思縱橫科技股份有限公司產(chǎn);JSM-7001E型掃描電鏡，日本JEOL公司產(chǎn);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn);EFZUV-4802H型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限公司產(chǎn).

1.2CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備

1.2.1制備方法

CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備：稱取一定量的CS溶液（將CS溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸），加入一定量的CA溶液，攪拌至固體完全溶解后，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NHS溶液，混合均勻，再加入一定量的EDC溶液，快速攪拌均勻后，靜置，形成CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠，備用.

CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備：將上述CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠浸泡在配制好的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的AAm溶液（含有APS，MBA）中，待其充分溶脹12h后，再于60℃條件下恒溫反應(yīng)12h，形成CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，備用.

1.2.2催化體系用量的確定

CS與CA在EDC和NHS的催化作用下，形成單網(wǎng)絡(luò)水凝膠.在該體系中，EDC/NHS催化CS中的氨基與檸檬酸中的羧基反應(yīng)，形成酰胺鍵，從而形成有效交聯(lián)，合成示意圖見圖1[13].根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，當(dāng)m（EDC）GA6FAm（NHS）=2GA6FA1時(shí)，具有最佳的催化效率.因此，在制備CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的過程中，以m（EDC）GA6FAm（NHS）=2GA6FA1為依據(jù)，通過改變EDC和NHS的用量，得到不同催化劑用量的CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠，分別測(cè)定其儲(chǔ)能模量，即可確定最優(yōu)的EDC用量.

1.2.3PAAm含量的確定

本文采用浸泡法制備第二網(wǎng)絡(luò)，而PAAm的含量對(duì)CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的性能會(huì)產(chǎn)生較大影響.水凝膠中PAAm含量的測(cè)定方法如下.

1）稱取兩個(gè)CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠樣品，質(zhì)量分別標(biāo)記為x和x′，一個(gè)直接用于干燥，稱重，記為y，凝膠中固態(tài)物質(zhì)固含量e=y/x;另一個(gè)放入透析袋中用去離子水充分透析后干燥，稱重，記為z，在水中非擴(kuò)散性物質(zhì)的固含量r=z/x′，通過探索性實(shí)驗(yàn)對(duì)比e值和r值，得到e>r，這可能是因?yàn)镋DC/NHS在透析過程中會(huì)溶于水而導(dǎo)致部分流失.因此，采用r值計(jì)算水凝膠中各組分之比例更為合適.

2）另稱取CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠樣品，質(zhì)量記為x″，按照1.2.1的方法制備雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，稱重，記為m.將獲得的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠放入透析袋中，用去離子水充分透析后，干燥，稱重，記為n，非擴(kuò)散性物質(zhì)在雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中所占比例q=n/m.

3）假定CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠、CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的干態(tài)質(zhì)量為稱取樣品總量，則水凝膠中CS和CA的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的含量為（x″×r）÷m×100%，PAAm網(wǎng)絡(luò)的含量為[n-（x″×r）]÷m×100%.重復(fù)3次，取平均值.

1.3測(cè)試與分析方法

流變性能測(cè)試：采用旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)水凝膠樣品進(jìn)行流變測(cè)試，測(cè)試溫度25℃，應(yīng)變的掃描范圍0.1%～100%，頻率1Hz;水凝膠樣品直徑20mm，厚度1.2mm.

力學(xué)性能測(cè)試：采用萬能試驗(yàn)機(jī)對(duì)水凝膠樣品進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試，壓縮樣品直徑20mm，厚度18mm，負(fù)載10kN，壓縮速度2mm/min，循環(huán)壓縮將樣品壓縮至原高的60%，重復(fù)壓縮實(shí)驗(yàn)3次，中間無停留時(shí)間;拉伸樣品長(zhǎng)50mm，寬10mm，厚度5mm，負(fù)載1kN，拉伸速度20mm/min，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行拉伸實(shí)驗(yàn)，得到應(yīng)力-應(yīng)變曲線.

微觀形貌分析：采用掃描電子顯微鏡對(duì)水凝膠樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，將水凝膠樣品放入加熱型冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，去除水分后，切片，進(jìn)行噴金處理，在25kV的加速電壓下進(jìn)行觀察.

溶脹性能分析：將水凝膠進(jìn)行自然干燥，待其水分全部去除后，稱量其干重，然后將樣品放入去離子水中，按照規(guī)定時(shí)間間隔取出稱重，待其溶脹平衡后結(jié)束.

其中，SR為溶脹率，Ws為溶脹時(shí)的質(zhì)量/g，Wd為干燥后的質(zhì)量/g.

溶血性能分析：參照文獻(xiàn)[15]中的溶血實(shí)驗(yàn)方法，取4mL新鮮抗凝兔血紅細(xì)胞置于離心管中，于2000r/min條件下離心5min，取0.2mL離心后的紅細(xì)胞加入到試管中，緩慢滴加10mL生理鹽水，隨后將0.2g水凝膠樣品加入到試管中，輕微搖動(dòng)，待其混勻后置于37℃恒溫水浴保溫并振蕩60min.向另外的試管中加入10mL去離子水作為陽性對(duì)照組，加入10mL生理鹽水作為陰性對(duì)照組.取出上述各試管中的溶液，于2000r/min條件下離心5min，取上清液，并通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量545nm處的吸光度值（OD），記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).樣品的溶血率HR（hemolysisrate）計(jì)算公式為

2結(jié)果與討論

2.1CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠催化劑體系用量的選擇結(jié)果

CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠各組分的用量和儲(chǔ)能模量（G′）結(jié)果見表1.由表1可知，EDC/NHS催化酰胺鍵形成的過程非常迅速，隨著EDC/NHS用量的增加，反應(yīng)速度急劇上升，超過一定比例后，即使在較低的反應(yīng)溫度下依然難以控制，導(dǎo)致形成的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不均勻.當(dāng)EDC催化劑用量為2.15%時(shí)，CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的儲(chǔ)能模量最高，為2791Pa.因此，在制備CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠時(shí)，選用EDC用量為2.15%時(shí)所得的CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠為第一網(wǎng)絡(luò).

2.2CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中PAAm含量測(cè)定結(jié)果

CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中各組分測(cè)定結(jié)果見表2.由表2可知，隨著浸泡溶液中

AAm含量的增加，CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中PAAm的固含量也有所增加;當(dāng)浸泡溶液中AAm含量超過25%時(shí)，CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中PAAm的固含量變化不大.這可能是因?yàn)?，此時(shí)水凝膠吸入的AAm已經(jīng)基本達(dá)到飽和，因而CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中的PAAm固含量也趨于穩(wěn)定.

2.3CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的流變性能分析

不同PAAm含量對(duì)CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠流變性能的影響見圖2.由圖2可以看出，在掃描應(yīng)變?yōu)?.1%～100%的測(cè)量范圍內(nèi)，該水凝膠的儲(chǔ)能模量G′，損耗模量G″和代表凝膠黏彈性的參數(shù)損耗因子tanδ（tanδ=G″/G′）均隨PAAm含量的增加而升高.其中，所有測(cè)試樣品的tanδ值均小于1，表示在測(cè)試范圍內(nèi)，CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠均能有效保持其化學(xué)交聯(lián)結(jié)構(gòu).對(duì)比圖2中的a），b），c）3張圖，所有水凝膠樣品的性能曲線都較為平滑，幾乎沒有跳點(diǎn)現(xiàn)象，這也表明水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.當(dāng)PAAm含量為34.6%時(shí)，CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的儲(chǔ)能模量最大，可達(dá)50kPa，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CS＼|CA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的2.8kPa.

2.4CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的力學(xué)性能分析

為了系統(tǒng)地評(píng)價(jià)PAAm含量對(duì)水凝膠力學(xué)性能的影響，使用表2中所得CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠進(jìn)行拉伸和壓縮實(shí)驗(yàn)，力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果見圖3.由圖3可以看出，隨著PAAm含量的增加，水凝膠的拉伸應(yīng)變和拉伸強(qiáng)度均有所增加，水凝膠由原來的幾乎不可拉伸到拉伸應(yīng)力達(dá)270kPa，拉伸應(yīng)變達(dá)110%，這說明PAAm的引入對(duì)水凝膠具有良好的增強(qiáng)、增韌作用.另外，體系中PAAm的含量極大地影響了水凝膠的壓縮性能，其壓縮應(yīng)變和壓縮強(qiáng)度均隨PAAm含量的增加而增加，這與水凝膠的拉伸性能一致.當(dāng)水凝膠中PAAm含量為34.6%時(shí)，在接近90%的壓縮應(yīng)變條件下，水凝膠仍能保持完整形態(tài).因此，以PAAm含量為34.6%的水凝膠為例，設(shè)置壓縮應(yīng)變?yōu)?0%，考察水凝膠的循環(huán)壓縮性能.由圖3c）可以看出，3次循環(huán)壓縮所得峰值應(yīng)力基本相同，且3次循環(huán)的滯后基本一致，幾乎沒有產(chǎn)生能量損耗，說明水凝膠具有良好的抗疲勞性[16].拉伸性能測(cè)試和壓縮性能測(cè)試結(jié)果均表明，引入PAAm的確改善了第一網(wǎng)絡(luò)的剛性，賦予凝膠韌性，并且凝膠柔性的大小與PAAm含量有關(guān).

2.5CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的微觀形貌分析

圖4為不同PAAm含量的CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的SEM圖.由圖4可以看出，當(dāng)PAAm含量為0%時(shí)，水凝膠孔洞較大，略微稀疏，孔徑在50μm左右;當(dāng)PAAm含量為7.8%時(shí)，其孔洞大小與單網(wǎng)絡(luò)凝膠十分相似，但是大孔洞周圍開始出現(xiàn)較為致密的小孔洞;當(dāng)PAAm含量增加到34.6%時(shí)，水凝膠內(nèi)部孔洞更加均勻、致密，孔洞較小，孔徑約5μm.PAAm的引入對(duì)水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)有較大影響，使水凝膠結(jié)構(gòu)更為緊密.另外，這種致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠可以承受比單網(wǎng)絡(luò)水凝膠更強(qiáng)的力，同時(shí)，均勻致密的網(wǎng)絡(luò)也有利于水凝膠在組織工程的應(yīng)用中提供適宜周圍細(xì)胞生長(zhǎng)的濕潤(rùn)環(huán)境，進(jìn)而有利于水凝膠包載并釋放藥物[17].從微觀結(jié)構(gòu)的角度也說明，PAAm的引入達(dá)到了提升CS水凝膠性能的目的.

2.6CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶脹性能分析

表3為不同PAAm含量的CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶脹率與溶脹平衡時(shí)間表.由表3可知，隨著PAAm的引入，凝膠溶脹率急劇降低，從644%降低到84%，溶脹平衡時(shí)間也由54h縮短至25h.這可能是因?yàn)殡S著PAAm的引入，水凝膠的固含量有所增加，從而使凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密;另一方面，可能是因?yàn)轶w系中的羧基與氨基發(fā)生了更為緊密的離子鍵和，從而導(dǎo)致雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶脹率與溶脹平衡時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于單網(wǎng)絡(luò)水凝膠[12].但是，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶脹率與溶脹平衡時(shí)間幾乎不隨PAAm含量的變化而變化，其相關(guān)溶脹機(jī)理需要進(jìn)一步探討.

2.7CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶血性能分析

不同PAAm含量的CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶血率如圖5所示.由圖5可以看出，水凝膠的溶血率均低于5%，符合文獻(xiàn)[18]中生物材料溶血率小于5%的國際標(biāo)準(zhǔn).這說明CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠幾乎不引起體外溶血反應(yīng)，基本可保持血液中紅細(xì)胞的完整性，具有良好的血液相容性.在本文研究范圍內(nèi)，溶血率隨著PAAm含量的增加而增加，但仍然在安全范圍之內(nèi)，可認(rèn)為本材料在該范圍內(nèi)不會(huì)發(fā)生急性溶血，無體外溶血反應(yīng)，安全性良好.

3結(jié)論

本文以CS，CA，AAm為原料，采用兩步法制備了性能良好的CS＼|CA/PAAm雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，并對(duì)不同PAAm含量水凝膠的流變性能、力學(xué)性能、微觀形貌等進(jìn)行了研究.結(jié)果表明，當(dāng)PAAm含量為34.6%時(shí)，儲(chǔ)能模量從原來單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的2.8kPa增加到50kPa，由原來的脆性凝膠變?yōu)閿嗔焉扉L(zhǎng)率高達(dá)110%和壓縮形變能力為90%的柔韌性凝膠，且具有良好的壓縮性能，在60%的應(yīng)變下循環(huán)壓縮3次，幾乎沒有滯后圈.此外，該水凝膠的內(nèi)部孔洞更加均勻、致密，孔徑約為5μm，由于具有更加致密多孔的微觀結(jié)構(gòu)，隨著PAAm的引入（含量為0～34.6%），其溶脹率從644%降低到84%，溶脹平衡時(shí)間由54h縮短至25h，且溶血率均小于5%，良好的抗溶血性質(zhì)沒有改變，為該水凝膠在軟骨修復(fù)、傷口敷料等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能.

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